Por qué importa el grosor del cubreobjetos en la microscopía
Mira cualquier objetivo de microscopio Plan Acromático y verás "0.17" impreso en el tubo. Se refiere al grosor del cubreobjetos en milímetros, la especificación del sustrato para la que el objetivo fue diseñado para enfocar. Cuando esa especificación no se cumple, la calidad de la imagen se deteriora. Esto es lo que significa ese número, por qué existe y qué sucede cuando se ignora.
El número en el tubo de tu objetivo
Los objetivos de microscopio Plan Acromáticos están diseñados en torno a un conjunto de parámetros ópticos precisos, incluyendo la magnificación lateral, el medio de inmersión (si se requiere), la apertura numérica, el grosor del cubreobjetos (estandarizado por la industria en 0,17 mm/170 µm) y a veces la distancia de trabajo.
El grosor estándar de 0,17 mm para cubreobjetos surgió de las propiedades físicas del vidrio de borosilicato y de los requisitos prácticos de la imagen biológica. A este grosor, el vidrio es lo suficientemente delgado para permitir distancias de trabajo cortas y ángulos altos de recolección de luz, mientras que es lo suficientemente robusto mecánicamente para manipularlo sin romperlo. Los fabricantes de objetivos han diseñado en torno a este valor durante más de un siglo, y la corrección incorporada en los objetivos apocromáticos modernos lo asume con precisión.
Desviarse del grosor estándar introduce errores ópticos que el objetivo no puede corregir por sí solo.
Cómo se corrigen los objetivos para el grosor del cubreobjetos
Para entender por qué el grosor importa, ayuda comprender qué significa realmente la corrección del objetivo a nivel de diseño de lentes.
La luz que proviene de una muestra biológica pasa a través del sustrato y a veces del medio (es decir, aceite), que es el cubreobjetos o el fondo de la placa, antes de entrar en el objetivo. Al cruzar la interfaz vidrio-medio de inmersión, se refracta. El ángulo y el grado de esa refracción dependen tanto del grosor del sustrato como de su índice de refracción. El diseño del objetivo generalmente tiene en cuenta esta refracción introduciendo elementos ópticos compensatorios dentro del propio tubo del objetivo. Estos elementos están calculados específicamente para 0,17 mm de vidrio de borosilicato con un índice de refracción de aproximadamente 1,515.
Esta corrección es la más elaborada y crítica en los objetivos apocromáticos (APO), que están corregidos cromáticamente para cuatro longitudes de onda y corregidos esféricamente para múltiples colores simultáneamente. Cuanta más corrección se incorpora en un objetivo, más precisamente depende de que se cumpla la especificación del sustrato. Un objetivo de inmersión en aceite plan-apocromático 100⨉ representa la cima de esta filosofía de diseño. Es extraordinariamente capaz dentro de sus parámetros de diseño y muy sensible a desviaciones en la configuración.
→ Para una explicación detallada de los tipos de objetivos, corrección de aberraciones y apertura numérica, consulte Comprendiendo los objetivos del microscopio.
Qué sucede cuando el grosor se desvía de 0.17 mm
Cuando la luz atraviesa un sustrato que es más grueso, más delgado o menos uniforme que la especificación de diseño del objetivo, la corrección compensatoria dentro del objetivo ya no coincide con la refracción real que ocurre en la interfaz del vidrio. El resultado es aberración esférica. Esta es una condición en la que los rayos de luz que entran al objetivo en diferentes ángulos se enfocan en puntos ligeramente distintos a lo largo del eje óptico en lugar de converger en un solo plano focal. En términos prácticos, la aberración esférica causada por un grosor incorrecto del sustrato produce:
Pérdida de resolución axial – Las estructuras a diferentes profundidades dentro de la muestra parecen enfocarse en puntos distintos, haciendo que la imagen en pilas z y la reconstrucción tridimensional sean poco fiables.
Reducción de la resolución lateral – Los detalles estructurales finos que deberían distinguirse se difuminan, reduciendo el poder de resolución efectivo del objetivo por debajo de su límite teórico.
Pérdida de intensidad – La luz que debería contribuir a la imagen enfocada se redistribuye en halos fuera de foco, reduciendo la intensidad de la señal y aumentando la intensidad del fondo.
Desplazamiento del enfoque – El plano focal aparente se desplaza respecto a la posición real de la muestra, lo que afecta la precisión del posicionamiento en z en imágenes cuantitativas y experimentos con células vivas.
Estos efectos aumentan con la apertura numérica (NA). Un objetivo seco de 10⨉ con una NA de 0.25 es relativamente tolerante a la variación del sustrato. Un objetivo de inmersión en aceite de 100⨉ con una NA de 1.4 no lo es. A altas NA, incluso una desviación de 10–20 µm en el grosor del sustrato produce una degradación medible de la imagen. Por eso, la especificación del sustrato es más importante precisamente donde el rendimiento de la imagen es más crítico, es decir, en los aumentos y resoluciones usados para imágenes celulares y subcelulares detalladas.
→ Para definiciones de apertura numérica, resolución y distancia de trabajo, consulte Conceptos básicos del microscopio.
Medios de inmersión y coincidencia del índice de refracción
El grosor del sustrato no actúa de forma aislada. Interactúa directamente con el medio de inmersión, el material que llena el espacio entre la lente frontal del objetivo y la superficie del sustrato.
Los objetivos de inmersión en aceite están diseñados para un aceite de inmersión específico con un índice de refracción de 1,515, que coincide estrechamente con el del vidrio de borosilicato. Esta coincidencia minimiza la refracción en la interfaz objetivo-sustrato y permite que la corrección interna del objetivo funcione como se pretende. Cuando el sustrato se desvía del vidrio de borosilicato en índice de refracción, grosor o ambos, la coincidencia del índice de refracción se rompe y la aberración esférica aumenta en consecuencia.
Los objetivos de inmersión en agua están diseñados para un índice de refracción de 1,33 y son inherentemente más tolerantes a la variación del sustrato, lo que los hace una mejor opción para muestras gruesas o al obtener imágenes a través de medios con alto contenido de agua. Los objetivos secos, que operan en aire con un índice de refracción de 1,00, son los más tolerantes a la variación del sustrato, pero también están limitados en NA y, por lo tanto, en resolución.
Para la imagen de fluorescencia de mayor resolución, que a menudo utiliza confocal, TIRF o superresolución, los objetivos de inmersión en aceite son estándar. También son los más sensibles a la especificación del sustrato. Usarlos con un sustrato que se desvía del vidrio de borosilicato de 0,17 mm compromete la coincidencia del índice de refracción para la que el objetivo fue diseñado, aumentando la aberración esférica causada por la desviación del grosor.
Anillos de corrección: una solución temporal, no definitiva
Algunos objetivos incluyen un anillo de corrección, que es un anillo ajustable en el barril del objetivo que desplaza los elementos internos de la lente para compensar la variación del grosor del sustrato. Los anillos de corrección son una herramienta útil, pero es importante entender sus límites.
Los anillos de corrección suelen acomodar un rango de grosores de sustrato (comúnmente de 0,14 mm a 0,20 mm), aunque esto varía según el objetivo. Dentro de ese rango, pueden reducir significativamente la aberración esférica causada por la variación del grosor. Son especialmente útiles al obtener imágenes a través de medios de profundidad variable o al trabajar con sustratos no estándar.
Sin embargo, los anillos de corrección tienen limitaciones prácticas significativas:
- Requieren ajuste manual y observación directa de la calidad de la imagen para configurarse correctamente. Este puede ser un proceso que consume mucho tiempo y que introduce variabilidad del operador, especialmente en flujos de trabajo de imagen automatizados o de alto rendimiento.
- Solo compensan la variación de grosor. No corrigen el desajuste del índice de refracción entre el material del sustrato y la especificación de diseño del objetivo. Una placa de plástico con el grosor correcto pero el índice de refracción incorrecto seguirá produciendo imágenes aberradas incluso con un collar de corrección correctamente ajustado.
- No están disponibles en todos los objetivos. Muchos objetivos apocromáticos de inmersión en aceite de alta NA, incluidos los usados para TIRF y superresolución, son objetivos de corrección fija que asumen vidrio de borosilicato de 0.17 mm sin acomodación para desviaciones.
El enfoque más confiable es eliminar completamente la variable del sustrato usando una placa que cumpla con la especificación, en lugar de compensar un sustrato que no lo hace.
→ Para orientación sobre el ajuste de enfoque y la configuración del microscopio, consulte Ajuste de un Microscopio.
Por qué las Placas de Plástico No Cumplen Esta Especificación
Las placas estándar de cultivo celular de plástico no cumplen con la especificación de grosor del cubreobjetos en dos aspectos simultáneamente.
- Las placas de poliestireno se fabrican con un grosor de base que típicamente varía entre 1 mm y 2 mm, muy por fuera de la especificación de 0.17 mm y mucho más allá del rango de compensación de cualquier collar de corrección. La luz que pasa a través del fondo de una placa de plástico encuentra muchas veces más material del que un objetivo de alta NA está corregido para manejar, introduciendo una severa aberración esférica que no puede ser ajustada.
- El poliestireno tiene un índice de refracción de aproximadamente 1.59, significativamente diferente del 1.515 del vidrio de borosilicato. Incluso si se pudiera fabricar una placa de plástico con un grosor de 0.17 mm, su desajuste en el índice de refracción aún comprometería la corrección óptica incorporada en el objetivo.
Estas dos desviaciones se agravan mutuamente. El resultado es que las placas de plástico son fundamentalmente incompatibles con el diseño óptico de objetivos de alta apertura numérica (NA), no como una cuestión de grado, sino como una cuestión de especificación. Ninguna cantidad de ajuste compensa completamente ambas variables simultáneamente.
Esta es la base óptica para la degradación de la imagen descrita en términos prácticos en Por qué las Placas de Petri de Plástico Distorsionan la Imagen de Fluorescencia. La aberración esférica, la pérdida de resolución y la reducción del contraste que experimentan los investigadores al obtener imágenes a través del plástico son la consecuencia directa de que el sustrato no cumple con las especificaciones de grosor y índice de refracción del cubreobjetos que dependen sus objetivos.
Cómo FluoroDish™ Cumple con el Estándar
Los platos de cultivo celular FluoroDish™ de WPI están fabricados con un fondo de vidrio de calidad óptica que coincide con el grosor estándar del cubreobjetos (~170 µm) y con el índice de refracción del vidrio de borosilicato. Esto significa que el sustrato cumple con ambas especificaciones que requieren los objetivos de alta apertura numérica.
La consecuencia práctica es la compatibilidad óptica completa con toda la gama de objetivos de alto rendimiento usados en microscopía de fluorescencia moderna [plan-apocromáticos, objetivos de inmersión en aceite y lentes de corrección fija usados para técnicas TIRF y de superresolución]. No se requiere ajuste del collarín de corrección. No se necesita compensación del índice de refracción. El objetivo funciona como fue diseñado.
FluoroDish™ también utiliza un adhesivo biocompatible y libre de citotoxinas para unir el fondo de vidrio, haciéndolo seguro para embriones, células primarias y modelos derivados de iPSC. Disponible en múltiples tamaños y compatible con recubrimientos superficiales que incluyen colágeno, polilisina-D y fibronectina, soporta una amplia gama de flujos experimentales en aplicaciones de imagen académicas, CRO y farmacéuticas.
→ Para orientación sobre cómo seleccionar el plato adecuado para su aplicación específica de microscopía, consulte Cómo elegir el plato de cultivo celular adecuado para microscopía.
Preguntas Frecuentes
¿Qué significa 0.17 en un objetivo de microscopio?
El número 0.17 impreso en un objetivo de microscopio se refiere al grosor recomendado del cubreobjetos en milímetros, que es el sustrato para el cual el objetivo fue corregido ópticamente para obtener imágenes. Los objetivos de alta apertura numérica están diseñados en torno a esta especificación, con elementos internos de la lente calculados para compensar la refracción introducida por 0.17 mm de vidrio de borosilicato. Usar un sustrato con diferente grosor o índice de refracción introduce aberración esférica que el objetivo no puede corregir de forma independiente.
¿Qué sucede si uso un cubreobjetos con un grosor incorrecto?
Usar un sustrato más grueso, más delgado o con mayor variabilidad que 0.17 mm introduce aberración esférica. Esta es una condición donde los rayos de luz que entran al objetivo en diferentes ángulos se enfocan en puntos ligeramente distintos. Las consecuencias prácticas incluyen reducción de la resolución lateral y axial, pérdida de intensidad de la señal, aumento del fondo y desplazamiento del plano focal. Estos efectos son más severos en aperturas numéricas altas, donde la corrección del objetivo está más estrechamente ligada a la especificación del sustrato.
¿Puedo usar un collarín de corrección para compensar el grosor de un plato de plástico?
No, no de manera efectiva. Los collarines de corrección pueden compensar variaciones en el grosor del sustrato dentro de un rango limitado, típicamente de 0.14 mm a 0.20 mm. Los platos plásticos estándar tienen un grosor base de 1 mm a 2 mm, que está muy fuera de este rango y no puede ser corregido. Además, los collarines de corrección no solucionan la descoincidencia del índice de refracción, y el poliestireno tiene un índice de refracción de aproximadamente 1.59 comparado con 1.515 del vidrio de borosilicato, una desviación que persiste independientemente del ajuste del collarín.
¿Por qué los objetivos de inmersión en aceite requieren vidrio con grosor de cubreobjetos?
Los objetivos de inmersión en aceite están diseñados para un índice de refracción específico que coincide entre el aceite de inmersión (n ≈ 1.515) y el vidrio de borosilicato (n ≈ 1.515). Esta coincidencia minimiza la refracción en la interfaz objetivo-sustrato y permite que la corrección interna del objetivo funcione como se espera. Cuando el material del sustrato se desvía del vidrio de borosilicato en grosor o índice de refracción, la coincidencia se rompe y la aberración esférica aumenta. Los objetivos de inmersión en aceite operan con las aperturas numéricas más altas y, por lo tanto, son los más sensibles a esta desviación.
¿Son compatibles los platos con fondo de vidrio con objetivos apocromáticos?
Sí, siempre que el fondo de vidrio esté fabricado con un grosor de cubreobjetos (~170 µm) y el índice de refracción correcto. FluoroDish™ cumple ambas especificaciones, haciéndolo totalmente compatible con objetivos plan-apocromáticos, incluidos los lentes de inmersión en aceite usados para microscopía confocal, TIRF y superresolución. No se requiere ajuste del collarín de corrección.
¿Afecta el grosor del cubreobjetos a todas las técnicas de microscopía por igual?
No. Las técnicas de menor aumento y menor NA son relativamente tolerantes a la variación del grosor del sustrato. La especificación se vuelve crítica para los objetivos de inmersión en aceite de alta NA usados en microscopía confocal, TIRF, técnicas de superresolución y microscopía de fluorescencia detallada. Estas técnicas operan en los límites de resolución definidos por la NA del objetivo, y la aberración esférica causada por un grosor incorrecto del sustrato reduce directamente la resolución y la calidad de la señal alcanzable en esos límites.
