Preguntas frecuentes sobre la medición TEER

Aquí hay algunas preguntas frecuentes (FAQ) sobre la medición TEER usando un EVOM2.

¿La resistencia eléctrica y la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) son lo mismo?

No. Obtenemos el valor TEER multiplicando el valor de resistencia bruto/obtenido en un voltímetro epitelial (como el EVOM2) por el área de crecimiento celular (por ejemplo, el área de una monocapa celular cultivada en un inserto de cultivo celular).

Por ejemplo, si cultivas células en un inserto de cultivo celular con un área de 0.5 cm².

La lectura de resistencia en un voltímetro epitelial (por ejemplo, EVOM2) muestra un valor de 300 Ω.

TEER= 300 Ω × 0.5 cm² = 150 Ω- cm²

¿Qué es un EndOhm?

El EndOhm es una cámara diseñada para el EVOM2 donde colocas un pozo removible para realizar las mediciones de resistencia. Esta cámara tiene electrodos en posiciones fijas y la posición y estabilidad de los electrodos tiene un gran impacto al medir la resistencia del tejido.

¿Cómo se usa un EVOM2 para medir la confluencia?

El EVOM2 funciona bajo el principio de que una vez que mides lo que llamamos el pozo “en blanco”, esta primera medición de resistencia contiene la suma de la resistencia del electrodo, la separación entre electrodos y la resistencia debida al volumen y la molaridad del medio líquido. (Cualquier diferencia de carga en los electrodos se anula por el método de medición del EVOM2 que invierte la polaridad y promedia los resultados.) Las mediciones periódicas sucesivas del pozo son una gráfica del crecimiento de la membrana mediante una medición de resistencia, y una vez que esta gráfica de resistencia se estabiliza, podemos decir que la membrana ha alcanzado la confluencia. El sistema EVOM2 funciona como un amplificador de pinza de voltaje y un sistema Ussing, pero sin la cámara especial Ussing. El sistema EVOM2 no es tan preciso como un Ussing, pero el propósito del sistema EVOM2 es determinar si una membrana está confluyente, no realizar análisis detallados. (Algunos análisis de permeabilidad de membranas pueden estudiarse con el sistema EVOM2, pero como un porcentaje de cambio en lugar de un valor absoluto de cambio.)

¿Por qué usar un EndOhm en lugar de un STX?

El EVOM2 detectará agujeros y vacíos en la membrana por encima de todo, ya que el flujo de electricidad buscará el punto de menor resistencia. Los electrodos de propósito general STX2 pueden flexionarse y cambiar la separación entre electrodos, y además el hecho de no mantenerlos quietos en un pozo puede añadir un error significativo en la resistencia. Por otro lado, los electrodos EndOhm están fijos en posición. Cuando se cuidan y pretratan adecuadamente en medio, ofrecen las lecturas de resistencia más estables, repetibles y confiables. La adición de electrodos concéntricos centrados también asegura que toda el área de la membrana esté expuesta al flujo de corriente eléctrica, por lo que no hay áreas en sombra debido a una colocación en el borde como puede ocurrir con el STX2. (Cabe señalar que el valor TEER esperado de base del tejido, si es de bajo valor de resistencia, puede dificultar las mediciones en membranas de gran área. Por ejemplo: si el valor TEER es 200Ω-cm², entonces un pozo de 12 mm será 1.13 veces menor para la misma medición de confluencia (176.9Ω). El mismo tejido de 200Ω en un pozo de 24 mm de diámetro es 4.52 veces menor o 44.2Ω. A medida que este número de resistencia disminuye por debajo de aproximadamente 100Ω, vemos más inestabilidad en los electrodos y esas lecturas pueden variar. Hemos encontrado que la “limpieza” y preacondicionamiento de los electrodos son esenciales para lecturas estables.)

¿Cómo limpio mi electrodo?

La limpieza de electrodos consiste en el uso periódico de un limpiador enzimático (Enzol, Tergazyme) y/o un remojo en lejía doméstica sin aroma (3% NaClO). La lejía sirve para recubrir las superficies de Ag a AgCl y disolver proteínas acumuladas. Ambos efectos conducen a inestabilidad en los electrodos. El limpiador enzimático es un agente seguro para eliminar residuos de los electrodos depositados por componentes del medio como DMEM. Si esto se permite acumular, la lectura de resistencia aumenta y también puede volverse inestable.

¿Qué hay del preacondicionamiento del electrodo?

El preacondicionamiento del electrodo es el remojo previo de los electrodos en el medio de medición durante un tiempo para permitir que cualquier líquido extraño migre fuera de los pellets permeables. El alcohol se usa comúnmente para esterilizar estos electrodos y el alcohol se empapa en ellos y actúa como una alta resistencia al flujo eléctrico. A medida que el alcohol se intercambia lentamente con el medio salino dentro del electrodo, los resultados de la lectura de resistencia se ven como un valor que desciende lentamente.

¿Puedes darme un sistema simple de adquisición de datos para TEER?

El Lab-Trax-4 es un grabador de datos analógico a digital silencioso, de 12 bits y cuatro canales, con velocidades de muestreo de hasta 10,000 muestras por segundo o 2500 s/S para los cuatro canales. Esta unidad se alimenta directamente por el puerto USB2 y puede usarse en una laptop en campo como unidad portátil. El hardware tiene cuatro entradas digitales y cuatro salidas digitales, si se necesitan.

El software LabScribe3 es fácil de usar y se actualiza frecuentemente para cumplir con las demandas más actuales. A medida que Microsoft continúa actualizando a sistemas operativos más nuevos, el hardware seguirá siendo compatible con nuevas versiones de LabScribe. También ahora es compatible con computadoras Mac y Linux. Si usas un STX2 para hacer estas mediciones, puede que necesites una mano extra para ingresar texto. Si ingresas tu texto en el campo de Marcas antes de hacer las mediciones, solo necesitas presionar la tecla Enter para colocar la marca cuando tu lectura TEER se haya estabilizado. Si usas un STX100, tendrás las manos libres para hacer anotaciones.

¿Cuáles son los desafíos en la medición TEER que puedo encontrar?

Esto fue escrito para abordar problemas con el STX2, pero también aplica al EndOhm.

Cualquiera de estos factores puede cambiar la lectura de resistencia:

• Separación entre electrodos. No expandas ni comprimas la separación del electrodo STX2.
• Resistencia del electrodo. Mantén los electrodos limpios y acondicionados.
• Profundidad del electrodo. Siempre sumerge los electrodos al menos 2 mm.
• Electrodos cerca de las paredes plásticas. Trata de mantener los electrodos alejados de las paredes del plato, si es posible.
• Colocación del electrodo. Si normalmente apoyas la pata más larga del electrodo en el fondo del plato, repite esa colocación para mantener la consistencia.
• Resistencia del fluido. No dejes que el medio se evapore ni lo diluyas.
• Niveles de fluido. Trata de mantener el mismo volumen de fluido para cada lectura. Una pequeña variación puede tener un gran efecto en un inserto pequeño.
• Movimiento excesivo. Trata de mantener los electrodos quietos. En algunos casos, se puede usar un soporte mecánico para electrodos.
• El lavado o cambio de medio puede causar una ruptura en la membrana del inserto de cultivo celular. El cambio de fluido debe hacerse con cuidado a lo largo de la pared de los insertos. Un pequeño espacio de tejido/capa celular levantada de la membrana del inserto puede abrir un camino claro para que el EVOM2 lea una resistencia menor. La corriente se filtra por este espacio en lugar de pasar a través de la membrana que contiene la monocapa celular, ya que la electricidad tiende a tomar el camino de menor resistencia. En tales casos, notarás una caída drástica en la resistencia. Cuando notes una disminución tan grande en el valor de resistencia, recomendamos que revises tu muestra (por ejemplo, monocapa celular en un inserto de cultivo celular) bajo un microscopio para ver si hay una ruptura en el filtro o una región vacía grande en el filtro que indique que un grupo de células se ha desprendido.

Tomar múltiples lecturas en el mismo pozo (3-5 veces) y calcular el promedio puede usarse para disminuir la variabilidad.

¿Puedes sugerir algunos parámetros experimentales que se pueden controlar para obtener resultados TEER consistentes?

• Se sabe que la temperatura afecta los valores TEER. Recomendamos mantener una temperatura constante para obtener valores consistentes. Dado que las lecturas se obtienen en medio de cultivo celular o tampón, recomendamos usar un baño de agua con temperatura fija para calentar el medio/tampón que se usará durante el experimento. Una temperatura constante del medio/tampón asegura una condición experimental constante. Recomendamos sacar la placa de pozos, que contiene células cultivadas en insertos, del incubador al menos 20 minutos para estabilizar la placa a temperatura ambiente antes de hacer las mediciones.
• Si usas una cámara EndOhm, asegúrate de mantener la misma distancia fija entre los electrodos superior e inferior para obtener lecturas consistentes. Si usas un electrodo tipo palillos (STX2), trata de mantenerlo en posición vertical mientras obtienes resultados. La consistencia en mantener la misma posición de sujeción de los electrodos tipo palillos durante un experimento se espera que muestre lecturas consistentes.
• Recomendamos usar el mismo fluido con la misma concentración iónica tanto en el lado apical (por ejemplo, la parte superior de un inserto de cultivo celular) como en el lado basolateral (por ejemplo, la parte inferior del inserto dentro de un pozo de una placa de 12 pozos). Durante la medición, si usas tampón PBS 1X en el lado apical, recomendamos usar tampón PBS 1X en el lado basolateral. También recomendamos que ambos niveles de fluido (dentro y fuera de los insertos) estén a la misma altura para minimizar diferencias de presión. Durante los experimentos, el pozo/lado apical se llena primero con fluido para evitar que la membrana se despegue del filtro por presiones hidrostáticas.
• La aplicación de volúmenes consistentes de fluido (medio/tampón) durante todos los experimentos reducirá la variabilidad de los datos.

Para más información, consulta Registro de mediciones TEER con un EVOM2.

NOTA: EVOM2 fue reemplazado por el EVOM™ Manual, y el sistema Ussing fue descontinuado.