Warum Kunststoff-Petri-Schalen die Fluoreszenzbildgebung negativ beeinflussen können

Wenn Ihre Fluoreszenzbilder unerwartete Hintergrundsignale, schwächere als erwartete Signale oder insgesamt schlechte Bildqualität zeigen, könnte Ihre Zellkulturschale das Problem sein. Hier ist die wissenschaftliche Erklärung, warum Kunststoff-Kulturschalen die Bildqualität negativ beeinflussen können und wie Sie bestätigen können, ob Ihr Substrat die Ursache des Problems ist.

Das Problem, das Forscher oft falsch zuordnen

In der Fluoreszenzmikroskopie sind Hintergrundsignal und optische Verzerrung mehr als nur Bildqualitätsprobleme. Sie sind Probleme der Datenqualität. Und in vielen Fällen ist die Quelle die Kulturschale selbst. Hohe Hintergrundsignale, schwache Fluoreszenz und Messungen, die zwischen den Durchgängen variieren, sind frustrierende Probleme in der Fluoreszenzmikroskopie und werden häufig fälschlicherweise der Probenvorbereitung oder den Instrumenteneinstellungen zugeschrieben. Die Schale ist selten die erste Variable, die Forscher in Betracht ziehen. 

Kunststoffzellkulturschalen, insbesondere solche aus Polystyrol, verursachen zwei unterschiedliche optische Probleme, die die Qualität der Fluoreszenzabbildung direkt beeinträchtigen. Zu verstehen, was sie sind und wie man sie erkennt, ist der erste Schritt zu ihrer Beseitigung.

Zwei separate Probleme, ein Substrat

Es ist wichtig, zwischen den beiden wirkenden Mechanismen zu unterscheiden, da sie Ihre Daten unterschiedlich beeinflussen und auf unterschiedliche Weise behandelt werden:

Optische Verzerrung ist ein physikalisches Problem. Plastik streut und lenkt Licht aufgrund von Unebenheiten in der Materialstärke und dem Brechungsindex um, was Schärfe und Kontrast verringert, bevor das Signal überhaupt Ihren Detektor erreicht. Polystyrol emittiert eigenes Licht, wenn es Anregungswellenlängen ausgesetzt wird, und fügt ein Hintergrundsignal hinzu, das direkt mit der Fluoreszenz Ihrer Probe konkurriert.

Autofluoreszenz ist ein Symptom verschiedener endogener Fluorophore. Viele Faktoren tragen zu diesem Phänomen bei, wie z. B. zelluläre Stoffwechsel-Coenzyme, ECM (extrazelluläre Matrixproteine), chemische Fixiermittel und unter anderem die Qualität des Substrats.

Das Ergebnis solcher Faktoren ist, dass Bilder gleichzeitig unscharf und verrauscht sind und zudem übermäßig gesättigt wirken, was eine genaue Interpretation selbst für erfahrene Forscher erschwert.

Optische Verzerrung: Wie Plastik Ihren Lichtweg beeinträchtigt

Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie hängt davon ab, dass das Licht auf einem präzisen, vorhersehbaren Weg von der Lichtquelle durch das Substrat, die Probe und zum Objektiv gelangt. Polystyrol stört dies auf zwei Arten.

Erstens hat Polystyrol einen höheren und weniger einheitlichen Brechungsindex als optisches Glas. Wenn Licht durch den Boden des Gefäßes tritt, lenken und streuen Unregelmäßigkeiten im Material den Lichtweg unvorhersehbar. Das praktische Ergebnis ist eine reduzierte Bildschärfe. Feine Strukturdetaillierungen erscheinen weicher oder größer als sie tatsächlich sind, und der Kontrast zwischen benachbarten Strukturen nimmt ab.

Zweitens werden Polystyrolgefäße mit Dickenvariationen über den Boden hergestellt. Hoch-NA-Objektive, wie die 60x- und 100x-Ölimmersion-Objektive, die für detaillierte Zellabbildungen verwendet werden, sind optisch für eine präzise Substratdicke von etwa 170 µm korrigiert, was einem Standard-Glasdeckglas entspricht. Wenn die Substratdicke variiert oder von dieser Spezifikation abweicht, nimmt die sphärische Aberration zu und die Auflösung sinkt, oft erheblich bei den Vergrößerungen, bei denen es am wichtigsten ist.
Für routinemäßige Bildgebung bei niedrigerer Vergrößerung sind diese Effekte möglicherweise tolerierbar. Für hochauflösende Strukturabbildung, Kolokalisationsanalysen oder jedes Experiment, bei dem räumliche Genauigkeit wichtig ist, führen sie zu Fehlern, die in der Nachbearbeitung schwer zu korrigieren sind.

Autofluoreszenz: Wenn das Gefäß selbst leuchtet

Polystyrol ist ein von Natur aus fluoreszierendes Material. Bei Anregung mit Licht emittiert es ein breites Hintergrundsignal, das mit vielen der in der Zellbiologieforschung häufig verwendeten fluoreszierenden Farbstoffe und Proteine überlappt.

Dies ist besonders ausgeprägt im blau-grünen Anregungsbereich, der dieselben Wellenlängen verwendet, um DAPI, Hoechst, GFP und FITC anzuregen. Dann konkurriert der Boden des Gefäßes jedes Mal mit Ihrem fluoreszierenden Marker, wenn die Lichtquelle eingeschaltet ist.
Die Folgen sind am schwerwiegendsten, wenn:

• Die Signalintensität ist gering, z. B. bei fluoreszierenden Proteinkonstrukten mit niedriger Expression oder endogen markierten Proteinen
  
• Lange Belichtungszeiten sind erforderlich, um das Signal zu erfassen
  
• Quantitative Messungen der Fluoreszenzintensität werden durchgeführt
  
• Mehrere Fluoreszenzkanäle werden im selben Experiment abgebildet

In diesen Szenarien fügt die Autofluoreszenz von Polystyrol nicht nur Rauschen hinzu. Sie kann Ihr Signal vollständig überdecken, quantitative Messungen verschieben und scheinbare Fluoreszenz in Kanälen erzeugen, in denen kein Marker vorhanden ist.

Warum Kunststoff fluoresziert

Polystyrol fluoresziert aufgrund seiner molekularen Struktur. Die Polymerketten, aus denen Polystyrol besteht, enthalten aromatische Ringe, zyklische Kohlenstoffstrukturen, die Anregungslicht leicht absorbieren und als breitbandige Fluoreszenz wieder emittieren. Dies ist eine inhärente Eigenschaft des Materials, kein Herstellungsfehler oder Kontaminationsproblem. Es kann nicht durch Waschen entfernt, mit Standardblockierungsreagenzien blockiert oder durch Anpassung der Aufnahmeparameter korrigiert werden. Das Hintergrundsignal ist im Gefäß eingebaut.

Die Autofluoreszenz in Kunststoffschalen ist ebenfalls nicht statisch. UV-Bestrahlung, wiederholte Sterilisationszyklen und längere oder unsachgemäße Lagerung können die Autofluoreszenz im Laufe der Zeit erhöhen, da die Polymerstruktur sich zersetzt. Dies ist ein praktischer Grund, warum das Hintergrundsignal zwischen Kunststoffschalenchargen, zwischen unter verschiedenen Bedingungen gelagerten Kunststoffschalen oder zwischen frühen und späten Verwendungen von Kunststoffschalen derselben Charge variieren kann, was eine Variable einführt, die in quantitativen Experimenten schwer zu berücksichtigen ist.
Glas verhält sich grundlegend anders. Borosilikatglas, das Material, das in präzisen optischen Anwendungen einschließlich Objektträgern verwendet wird, enthält nicht die aromatischen Polymerstrukturen, die für die Fluoreszenz von Polystyrol verantwortlich sind. Seine Autofluoreszenz im sichtbaren Spektrum ist vernachlässigbar, weshalb es schon lange vor der Existenz der Lebendzellbildgebung das bevorzugte Substrat in der optischen Instrumentierung war. Für die Fluoreszenzmikroskopie bedeutet dies, dass nur das Signal Ihren Detektor erreicht, das Ihr Experiment erzeugen soll.

Welche Experimente am anfälligsten sind

Während Kunststoffschalen die Fluoreszenzbildgebung in gewissem Maße beeinflussen, sind bestimmte Arbeitsabläufe besonders betroffen:

Fluoreszierende Reporter mit niedriger Expression — endogen markierte Proteine, Knock-in-Reporter und Konstrukte, die von schwachen Promotoren exprimiert werden, erzeugen Signalstärken, bei denen Autofluoreszenz-Hintergrund am wahrscheinlichsten stört.

Multiplex-Immunfluoreszenz-Panels — mehrere Kanäle erhöhen die kumulative Auswirkung der Autofluoreszenz und erschweren die spektrale Entmischung.

Quantitative Fluoreszenzintensitätsmessungen — jeder Test, bei dem absolute oder relative Signalintensität gemessen wird, wird direkt durch ein variables Hintergrundsignal des Substrats beeinträchtigt.

Lebendzell-Zeitrafferaufnahmen — lange Bildgebungs-Sitzungen akkumulieren Hintergrundrauschen über die Zeit und erfordern thermische Stabilität, die Kunststoff nicht so zuverlässig wie Glas bietet.

Superauflösungsmikroskopie — Techniken wie STORM, PALM und STED arbeiten an den Grenzen der optischen Auflösung und sind sehr empfindlich gegenüber jeglichen Hintergrundquellen oder Aberrationen.

Wie Sie erkennen, ob Ihre Schale das Problem ist

Wenn Sie unerklärlichen Hintergrundsignal oder inkonsistente Fluoreszenzergebnisse haben, kann diese Checkliste helfen, zu erkennen, ob das Substrat die Ursache ist:

• Machen Sie ein Bild von einer leeren Schale ohne Zellen und ohne Markierung unter Ihren Standard-Anregungsbedingungen. Ein sichtbares Signal bestätigt die Autofluoreszenz des Substrats.
  
• Vergleichen Sie verschiedene Anregungswellenlängen. Die Autofluoreszenz von Polystyrol ist im blau-grünen Bereich am stärksten. Wenn der Hintergrund in DAPI- oder GFP-Kanälen stärker ist als in roten Kanälen, ist Kunststoff wahrscheinlich ein Beitragender.
  
• Wechseln Sie unter identischen Bedingungen zu einer Glasbodenschale. Eine signifikante Reduktion des Hintergrundsignals bestätigt, dass das Substrat das Problem war.
  
• Überprüfen Sie die Variabilität zwischen Schalen. Wenn die Hintergrundwerte zwischen Schalen derselben Charge variieren, tragen Dicken- und Brechungsindexunterschiede im Kunststoff zur Verzerrung bei.
  
• Testen Sie an einem anderen Mikroskopsystem. Wenn das Problem mit der Schale und nicht mit dem Instrument zusammenhängt, ist das Substrat eine zu behebende Variable.

Wie Glas beide Probleme beseitigt

Optisches Glas löst beide Probleme an der Quelle. Sein einheitlicher Brechungsindex und die präzise kontrollierte Dicke eliminieren die Lichtstreuung und sphärische Aberration, die Kunststoff verursacht. Die vernachlässigbare Autofluoreszenz im sichtbaren Spektrum entfernt das Hintergrundsignal vollständig, sodass nur die Fluoreszenz übrig bleibt, die Ihr Experiment nachweisen soll.

Glasbodenschalen, die in Deckglasdicke (~170 µm) hergestellt sind, sind vollständig kompatibel mit Hoch-NA-Ölimmersion-Objektiven, Konfokalsystemen, TIRF und Superauflösungsplattformen – den Instrumenten, bei denen die Einschränkungen von Kunststoff am gravierendsten sind.

→ Für einen Überblick, wie Glas und Kunststoff in allen wichtigen Bildeigenschaften verglichen werden, siehe Glas vs. Kunststoff Zellkulturschalen: Welche ist besser für die Bildgebung?

FluoroDish™ von WPI: Entwickelt zur Eliminierung von Substratvariablen

Die FluoroDish™ Zellkulturschalen von WPI beheben beide Ursachen der Bildverschlechterung direkt. Der optische Glasboden wird in Standarddeckglasdicke (~170 µm) hergestellt, was die Kompatibilität mit Hoch-NA-Objektiven sicherstellt und die Dickenvariationen eliminiert, die sphärische Aberrationen in Kunststoffschalen verursachen. Die nicht-fluoreszierende Glasoberfläche erzeugt im sichtbaren Spektrum ein vernachlässigbares Hintergrundsignal.

FluoroDish™ verwendet außerdem einen biokompatiblen, zytotoxinfrei Klebstoff, um den Glasboden zu verbinden – ein wichtiger Aspekt für Forscher, die mit Embryonen, Primärzellen oder iPSC-abgeleiteten Modellen arbeiten, bei denen das Auswaschen von Klebstoff die Zellvitalität beeinträchtigen oder experimentelle Ergebnisse verfälschen könnte.

FluoroDish™ ist in mehreren Größen erhältlich und kompatibel mit Oberflächenbeschichtungen wie Kollagen, Poly-D-Lysin und Fibronectin. Es unterstützt eine breite Palette von Zelltypen und experimentellen Arbeitsabläufen in akademischen, CRO- und Pharmaumgebungen.

→ Für Hinweise zur Auswahl der richtigen Dish-Konfiguration für Ihre spezifische Anwendung siehe Wie man die richtige Zellkulturschale für die Mikroskopie auswählt.

 

DETAILS ZUM FLUORODISH

 

Häufig gestellte Fragen

Warum hat mein Fluoreszenzbild ein hohes Hintergrundsignal? 
Ein hoher Hintergrund bei der Fluoreszenzbildgebung kann verschiedene Ursachen haben, aber die Zellkulturschale wird häufig übersehen. Polystyrolschalen emittieren Autofluoreszenz, wenn sie dem Anregungslicht ausgesetzt sind, was ein unspezifisches Signal erzeugt, das von echter Probenfluoreszenz nicht zu unterscheiden ist. Die Bildgebung einer leeren Kunststoffschale unter Ihren Standardanregungsbedingungen bestätigt, ob das Substrat beiträgt. Der Wechsel zu einer Glasbodenschale ist der direkteste Weg, substratbedingten Hintergrund zu eliminieren.

Können Kunststoffschalen falsch positive Fluoreszenzergebnisse verursachen? 
Ja. Die Autofluoreszenz von Polystyrol kann in Kanälen ein Signal erzeugen, in denen kein fluoreszierender Marker vorhanden ist, insbesondere im blau-grünen Anregungsbereich, der für DAPI, GFP und FITC verwendet wird. In multiplexen Experimenten kann dies als unspezifische Markierung oder unerwartete Kolokalisierung erscheinen. Die Bestätigung der Ergebnisse auf Glasbodenschalen ist eine zuverlässige Methode, um festzustellen, ob ein scheinbares Signal echt oder substratbedingt ist.

Welche Fluoreszenzkanäle sind am stärksten von der Autofluoreszenz durch Kunststoff betroffen? 
Die Autofluoreszenz von Polystyrol ist im blau-grünen Bereich am stärksten, weshalb die Kanäle DAPI, Hoechst, GFP und FITC am anfälligsten sind. Fernrote Kanäle sind im Allgemeinen weniger betroffen, weshalb Forscher bei der Arbeit mit Kunststoffschalen manchmal auf fernrote Fluorophore umsteigen. Der Wechsel zu Glas ist eine umfassendere Lösung, die das Problem in allen Kanälen beseitigt.

Wie erkenne ich, ob meine Zellkulturschale Bildgebungsartefakte verursacht? 
Der zuverlässigste Test besteht darin, eine leere Schale unter Ihren Standardaufnahmebedingungen zu fotografieren. Ein sichtbares Signal bestätigt die Autofluoreszenz des Substrats. Sie können auch Bilder vergleichen, die unter identischen Bedingungen auf Kunststoff- und Glasbodenschalen aufgenommen wurden. Eine deutliche Reduktion des Hintergrunds auf Glas bestätigt, dass das Substrat die Quelle des Artefakts ist.

Welches ist die beste Schale für die Bildgebung von niedrig exprimierten fluoreszenten Proteinen? 
Glasbodenschalen werden für alle Experimente mit niedrig exprimierten fluoreszenten Konstrukten dringend empfohlen. Wenn die Signalstärke von Natur aus gering ist, wirkt sich die Autofluoreszenz von Kunststoffsubstraten proportional stärker auf das Signal-Rausch-Verhältnis aus. Glasbodenschalen, die auf die Deckglastdicke abgestimmt sind, wie FluoroDish™, bieten die für diese Experimente erforderliche Umgebung mit niedrigem Hintergrund und hoher Auflösung.

Beeinflusst die Verzerrung durch Kunststoff alle Mikroskopobjektive gleichermaßen?
Nein. Objektive mit niedrigerer Vergrößerung und niedrigerer numerischer Apertur (NA) sind weniger empfindlich gegenüber Variationen der Substratdicke und Inkonsistenzen im Brechungsindex. Das Problem wird besonders bei hoch-NA-Ölimmersion-Objektiven (60x, 100x) relevant, die optisch für eine präzise Deckglastdicke korrigiert sind. Die Verwendung dieser Objektive mit Kunststoffschalen erhöht die sphärische Aberration und verringert die Auflösung bei den Vergrößerungen, bei denen strukturelle Details am wichtigsten sind.