Warum die Dicke des Deckglases in der Mikroskopie wichtig ist

Schauen Sie sich ein beliebiges Plan-Achromat-Mikroskopobjektiv an, und Sie werden „0,17“ auf dem Tubus gedruckt sehen. Dies bezieht sich auf die Deckglasdicke in Millimetern, die Substratspezifikation, für die das Objektiv entwickelt wurde. Wenn diese Spezifikation nicht eingehalten wird, leidet die Bildqualität. Hier erfahren Sie, was diese Zahl bedeutet, warum sie existiert und was passiert, wenn sie ignoriert wird.

Die Zahl auf Ihrem Objektivtubus

Plan-Achromat-Mikroskopobjektive sind um eine Reihe präziser optischer Parameter herum konstruiert, darunter die laterale Vergrößerung, das Immersionsmedium (falls erforderlich), die numerische Apertur, die Deckglasdicke (von der Industrie standardisiert auf 0,17 mm/170 µm) und manchmal der Arbeitsabstand.

Die Standarddicke von 0,17 mm für Deckgläser entstand aus den physikalischen Eigenschaften von Borosilikatglas und den praktischen Anforderungen der biologischen Bildgebung. Bei dieser Dicke ist das Glas dünn genug, um kurze Arbeitsabstände und hohe Lichteinfallswinkel zu ermöglichen, gleichzeitig aber mechanisch robust genug, um ohne Bruch gehandhabt zu werden. Objektivhersteller haben sich seit über einem Jahrhundert an diesem Wert orientiert, und die Korrektur moderner Apochromat-Objektive geht genau von diesem Wert aus.

Abweichungen von der Standarddicke führen zu optischen Fehlern, die das Objektiv nicht eigenständig korrigieren kann.

Wie Objektive für die Deckglasdicke korrigiert werden

Um zu verstehen, warum die Dicke wichtig ist, hilft es zu verstehen, was Objektivkorrektur auf Linsendesign-Ebene tatsächlich bedeutet.

Licht, das von einer biologischen Probe ausgeht, durchquert das Substrat und manchmal ein Medium (z. B. Öl), also das Deckglas oder den Boden der Schale, bevor es in das Objektiv eintritt. Beim Übergang von Glas zum Immersionsmedium wird das Licht gebrochen. Der Winkel und das Ausmaß dieser Brechung hängen sowohl von der Dicke des Substrats als auch von seinem Brechungsindex ab. Das Objektivdesign berücksichtigt diese Brechung in der Regel, indem es im Objektivtubus selbst ausgleichende optische Elemente einfügt. Diese Elemente sind speziell für 0,17 mm Borosilikatglas mit einem Brechungsindex von etwa 1,515 berechnet.

Diese Korrektur ist am ausgefeiltesten und am kritischsten bei Apochromat-(APO)-Objektiven, die chromatisch für vier Wellenlängen korrigiert und sphärisch für mehrere Farben gleichzeitig korrigiert sind. Je mehr Korrektur in ein Objektiv eingebaut ist, desto präziser muss die Spezifikation des Substrats eingehalten werden. Ein Plan-Apochromat 100⨉ Öl-Immersionsobjektiv stellt den Höhepunkt dieser Designphilosophie dar. Es ist innerhalb seiner Designparameter außergewöhnlich leistungsfähig und sehr empfindlich gegenüber Abweichungen in der Einstellung.

→ Für eine ausführliche Erklärung der Objektivtypen, Aberrationskorrektur und numerischen Apertur siehe Verständnis von Mikroskop-Objektiven.

Was passiert, wenn die Dicke von 0,17 mm abweicht

Wenn Licht durch ein Substrat mit einer Dicke, die dicker, dünner oder weniger gleichmäßig ist als die Konstruktionsspezifikation des Objektivs, hindurchtritt, stimmt die im Objektiv eingebaute Korrektur nicht mehr mit der tatsächlichen Brechung an der Glasgrenze überein. Das Ergebnis ist sphärische Aberration. Dabei fokussieren Lichtstrahlen, die das Objektiv unter verschiedenen Winkeln betreten, leicht versetzt entlang der optischen Achse, anstatt in einer einzigen Fokusebene zusammenzulaufen. Praktisch führt sphärische Aberration durch falsche Substratdicke zu:

Verlust der axialen Auflösung – Strukturen in unterschiedlichen Tiefen der Probe erscheinen an verschiedenen Punkten fokussiert, was Z-Stack-Bildgebung und dreidimensionale Rekonstruktion unzuverlässig macht.

Verminderte laterale Auflösung – Feine Strukturdetaills, die unterscheidbar sein sollten, verschwimmen, wodurch die effektive Auflösung des Objektivs unter seine theoretische Grenze sinkt.

Intensitätsverlust – Licht, das zum scharfen Bild beitragen sollte, wird in unscharfe Halos umverteilt, wodurch die Signalintensität sinkt und die Hintergrundintensität steigt.

Fokusverschiebung – Die scheinbare Fokusebene verschiebt sich relativ zur tatsächlichen Position der Probe, was die Genauigkeit der Z-Positionierung bei quantitativer Bildgebung und Live-Zell-Experimenten beeinträchtigt.

Diese Effekte steigen mit der NA. Ein 10⨉ Trockenobjektiv mit einer NA von 0,25 ist relativ tolerant gegenüber Substratvariationen. Ein 100⨉ Öl-Immersionsobjektiv mit einer NA von 1,4 hingegen nicht. Bei hoher NA führt bereits eine Abweichung der Substratdicke von 10–20 µm zu messbarer Bildverschlechterung. Deshalb ist die Substratspezifikation besonders dort wichtig, wo die Bildqualität am wichtigsten ist, nämlich bei den Vergrößerungen und Auflösungen, die für detaillierte zelluläre und subzelluläre Bildgebung verwendet werden.

→ Für Definitionen von numerischer Apertur, Auflösung und Arbeitsabstand siehe Mikroskop-Grundlagen.

Immersionsmedien und Brechungsindex-Anpassung

Die Substratdicke wirkt nicht isoliert. Sie interagiert direkt mit dem Immersionsmedium, dem Material, das den Raum zwischen der vorderen Linse des Objektivs und der Substratoberfläche füllt.

Öl-Immersionsobjektive sind für ein spezielles Immersionsöl mit einem Brechungsindex von 1,515 ausgelegt, das dem von Borosilikatglas sehr nahekommt. Diese Anpassung minimiert die Brechung an der Schnittstelle zwischen Objektiv und Substrat und ermöglicht, dass die interne Korrektur des Objektivs wie vorgesehen funktioniert. Wenn das Substrat im Brechungsindex, in der Dicke oder in beidem vom Borosilikatglas abweicht, bricht die Brechungsindexanpassung zusammen und die sphärische Aberration nimmt entsprechend zu.

Wasser-Immersionsobjektive sind für einen Brechungsindex von 1,33 ausgelegt und tolerieren Substratvariationen von Natur aus besser, was sie zur besseren Wahl für dicke Proben oder das Imaging durch Medien mit hohem Wasseranteil macht. Trockenobjektive, die in Luft mit einem Brechungsindex von 1,00 arbeiten, sind am tolerantesten gegenüber Substratvariationen, sind jedoch in der numerischen Apertur (NA) und damit in der Auflösung eingeschränkt.

Für die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung, oft mit konfokalen, TIRF- oder Superauflösungs-Techniken, sind Öl-Immersionsobjektive Standard. Sie sind auch am empfindlichsten gegenüber Substratspezifikationen. Die Verwendung mit einem Substrat, das von 0,17 mm Borosilikatglas abweicht, beeinträchtigt die Brechungsindexanpassung, für die das Objektiv ausgelegt ist, und verstärkt die durch Dickenabweichung verursachte sphärische Aberration.

Korrekturkragen: Eine Notlösung, keine endgültige Lösung

Einige Objektive verfügen über einen Korrekturkragen, einen verstellbaren Ring am Objektivtubus, der die internen Linsenelemente verschiebt, um Dickenvariationen des Substrats auszugleichen. Korrekturkragen sind ein nützliches Werkzeug, aber es ist wichtig, ihre Grenzen zu verstehen.

Korrekturkragen sind typischerweise für eine Reihe von Substratdicken ausgelegt (häufig 0,14 mm bis 0,20 mm), wobei dies je nach Objektiv variiert. Innerhalb dieses Bereichs können sie sphärische Aberrationen, die durch Dickenvariation entstehen, deutlich reduzieren. Sie sind besonders nützlich beim Imaging durch Medien mit variierender Tiefe oder bei der Arbeit mit nicht standardmäßigen Substraten.

Korrekturkragen haben jedoch erhebliche praktische Einschränkungen:

• Sie erfordern eine manuelle Einstellung und direkte Beobachtung der Bildqualität, um korrekt eingestellt zu werden. Dies kann ein zeitaufwändiger Prozess sein, der insbesondere bei automatisierten oder hochdurchsatzfähigen Bildgebungsabläufen zu Bedienerabweichungen führt.
• Sie kompensieren nur Dickenvariationen. Sie korrigieren nicht den Brechungsindexunterschied zwischen dem Substratmaterial und der Design-Spezifikation des Objektivs. Eine Kunststoffschale mit der richtigen Dicke, aber dem falschen Brechungsindex erzeugt auch mit korrekt eingestelltem Korrekturring noch aberrierte Bilder.
• Sie sind nicht für alle Objektive verfügbar. Viele Hoch-NA-Ölimmersion-Apochromate, einschließlich der für TIRF und Superauflösung verwendeten, sind Objektive mit fester Korrektur, die von 0,17 mm Borosilikatglas ausgehen und keine Abweichungen berücksichtigen.

Der zuverlässigste Ansatz ist, die Variable Substrat vollständig zu eliminieren, indem eine Schale verwendet wird, die die Spezifikation erfüllt, anstatt für ein Substrat zu kompensieren, das dies nicht tut.

→ Für Hinweise zur Fokuseinstellung und Mikroskopkonfiguration siehe Ein Mikroskop einstellen.

Warum Kunststoffschalen diese Spezifikation nicht erfüllen

Standard-Kunststoffzellkulturschalen erfüllen die Spezifikation für die Deckglasdicke in zweifacher Hinsicht nicht gleichzeitig.

• Polystyrolschalen werden mit einer Bodendicke von typischerweise 1 mm bis 2 mm hergestellt, was weit außerhalb der 0,17-mm-Spezifikation liegt und die Kompensationsmöglichkeiten eines Korrekturrings bei weitem übersteigt. Licht, das durch den Boden einer Kunststoffschale fällt, durchquert ein Vielfaches des Materials, für das ein Hoch-NA-Objektiv korrigiert ist, was zu schweren sphärischen Aberrationen führt, die nicht ausgeglichen werden können.
• Polystyrol hat einen Brechungsindex von etwa 1,59, was sich deutlich vom Wert 1,515 von Borosilikatglas unterscheidet. Selbst wenn eine Kunststoffschale mit einer Dicke von 0,17 mm hergestellt werden könnte, würde die Abweichung im Brechungsindex die optische Korrektur des Objektivs weiterhin beeinträchtigen.

Diese beiden Abweichungen verstärken sich gegenseitig. Das Ergebnis ist, dass Kunststoffschalen grundsätzlich mit dem optischen Design von Hoch-NA-Objektiven unvereinbar sind, nicht nur in einem gewissen Maße, sondern aufgrund der Spezifikation. Keine Einstellung kann beide Variablen gleichzeitig vollständig ausgleichen.

Dies ist die optische Grundlage für die in praktischen Begriffen beschriebene Bildverschlechterung in Warum Plastik-Petri-Schalen die Fluoreszenzbildgebung verzerren. Die sphärische Aberration, der Auflösungsverlust und die Kontrastminderung, die Forscher beim Imaging durch Kunststoff erleben, sind die direkte Folge davon, dass das Substrat die Spezifikationen für Deckglasdicke und Brechungsindex, von denen ihre Objektive abhängen, nicht erfüllt.

Wie FluoroDish™ den Standard erfüllt

Die FluoroDish™ Zellkulturschalen von WPI werden mit einem optisch hochwertigen Glasboden hergestellt, der der Standard-Deckglasdicke (~ 170 µm) mit dem Brechungsindex von Borosilikatglas entspricht. Das bedeutet, dass das Substrat beide Spezifikationen erfüllt, die hoch-NA-Objektive benötigen.

Die praktische Folge ist die vollständige optische Kompatibilität mit dem gesamten Spektrum hochleistungsfähiger Objektive, die in der modernen Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden [Plan-Apochromate, Öl-Immersionsobjektive und die Festkorrekturobjektive, die für TIRF- und Superauflösungstechniken eingesetzt werden]. Es ist keine Einstellung des Korrekturrings erforderlich. Keine Kompensation des Brechungsindex ist notwendig. Das Objektiv arbeitet so, wie es vom Hersteller vorgesehen ist.

FluoroDish™ verwendet außerdem einen biokompatiblen, zytotoxinfrei Klebstoff, um den Glasboden zu befestigen, wodurch es sicher für Embryonen, Primärzellen und iPSC-abgeleitete Modelle ist. Erhältlich in verschiedenen Größen und kompatibel mit Oberflächenbeschichtungen wie Kollagen, Poly-D-Lysin und Fibronectin unterstützt es eine breite Palette experimenteller Arbeitsabläufe in akademischen, CRO- und Pharma-Imaging-Anwendungen.

→ Für Hinweise zur Auswahl der richtigen Schale für Ihre spezifische Mikroskopieanwendung siehe Wie man die richtige Zellkulturschale für die Mikroskopie auswählt.

 

FLUORODISH™ DETAILS

Häufig gestellte Fragen

Was bedeutet 0,17 auf einem Mikroskopobjektiv?
Die Zahl 0,17, die auf einem Mikroskopobjektiv aufgedruckt ist, bezieht sich auf die empfohlene Deckglasdicke in Millimetern, also das Substrat, für das das Objektiv optisch korrigiert wurde. Hoch-NA-Objektive sind auf diese Spezifikation ausgelegt, wobei die internen Linsenelemente so berechnet sind, dass sie die Brechung ausgleichen, die durch 0,17 mm Borosilikatglas verursacht wird. Die Verwendung eines Substrats mit anderer Dicke oder anderem Brechungsindex führt zu sphärischer Aberration, die das Objektiv nicht eigenständig korrigieren kann.

Was passiert, wenn ich eine falsche Deckglasdicke verwende?
Die Verwendung eines Substrats, das dicker, dünner oder variabler als 0,17 mm ist, führt zu sphärischer Aberration. Dabei handelt es sich um einen Zustand, bei dem Lichtstrahlen, die unter verschiedenen Winkeln in das Objektiv eintreten, leicht unterschiedliche Brennpunkte haben. Die praktischen Folgen sind eine verringerte laterale und axiale Auflösung, ein Verlust der Signalintensität, ein erhöhter Hintergrund und eine Verschiebung der Fokusebene. Diese Effekte sind bei hohen numerischen Aperturen am stärksten, da die Korrektur des Objektivs hier am engsten an die Substratspezifikation gekoppelt ist.

Kann ich einen Korrekturring verwenden, um die Dicke einer Plastikschale auszugleichen?
Nein, nicht effektiv. Korrekturringe können Schwankungen der Substratdicke nur in einem begrenzten Bereich ausgleichen, typischerweise 0,14 mm bis 0,20 mm. Standard-Plastikschalen haben eine Bodendicke von 1 mm bis 2 mm, was weit außerhalb dieses Bereichs liegt und nicht korrigiert werden kann. Außerdem beheben Korrekturringe keine Abweichungen im Brechungsindex, und Polystyrol hat einen Brechungsindex von etwa 1,59 im Vergleich zu 1,515 für Borosilikatglas – eine Abweichung, die unabhängig von der Einstellung des Rings bestehen bleibt.

Warum benötigen Ölimmersion-Objektive Glas mit Deckglasdicke?
Ölimmersion-Objektive sind auf eine spezifische Übereinstimmung des Brechungsindexes zwischen Immersionsöl (n ≈ 1,515) und Borosilikatglas (n ≈ 1,515) ausgelegt. Diese Übereinstimmung minimiert die Brechung an der Schnittstelle zwischen Objektiv und Substrat und ermöglicht, dass die interne Korrektur des Objektivs wie vorgesehen funktioniert. Wenn das Substratmaterial in Dicke oder Brechungsindex vom Borosilikatglas abweicht, bricht die Übereinstimmung zusammen und die sphärische Aberration nimmt zu. Ölimmersion-Objektive arbeiten mit den höchsten numerischen Aperturen und sind daher am empfindlichsten gegenüber dieser Abweichung.

Sind Glaskulturschalen mit Apochromat-Objektiven kompatibel?
Ja, vorausgesetzt, der Glasboden ist auf die Deckglasdicke (~170 µm) mit dem korrekten Brechungsindex gefertigt. FluoroDish™ erfüllt beide Spezifikationen und ist somit vollständig kompatibel mit Plan-Apochromat-Objektiven, einschließlich Ölimmersion-Linsen, die für Konfokal-, TIRF- und Superauflösungsmikroskopie verwendet werden. Eine Korrekturring-Einstellung ist nicht erforderlich.

Beeinflusst die Dicke des Deckglases alle Mikroskopietechniken gleichermaßen?
Nein. Techniken mit niedriger Vergrößerung und niedriger numerischer Apertur (NA) sind relativ tolerant gegenüber Schwankungen der Substratdicke. Die Spezifikation wird jedoch kritisch für Hoch-NA-Ölimmersion-Objektive, die in der Konfokalmikroskopie, TIRF, Superauflösungstechniken und detaillierter Fluoreszenzbildgebung verwendet werden. Diese Techniken arbeiten an den Auflösungsgrenzen, die durch die NA des Objektivs definiert sind, und sphärische Aberrationen durch falsche Substratdicke verringern direkt die erreichbare Auflösung und Signalqualität an diesen Grenzen.