Quantifizierung der Barriereintegrität in Organ-on-Chip-Plattformen
Die EVOM™ Chip-Plattform ermöglicht hochpräzise TEER-Messungen in Echtzeit, mit denen sich die Reifung und entzündungsbedingte Beeinträchtigung von Barrieren in Endothel- und BBB-Modellen erfassen lassen. So wird eine standardisierte, skalierbare Bewertung der Barrierefunktion in mikrophysiologischen Systemen ermöglicht.
Zusammenfassung
Die quantitative Echtzeitbewertung der Barriereintegrität ist grundlegend für die Modellierung der neurovaskulären Physiologie und der Funktion der Blut-Hirn-Schranke (BBB) in vitro. In dieser Studie wurde die EVOM™ Chip-Plattform verwendet, um den transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER) sowohl in Modellen des Gefäßendothels als auch in primären BBB-Tri-Kulturmodellen zu überwachen. Die TEER-Messungen zeigten eine robuste Barrierebildung im Zeitverlauf und wiesen nach der Exposition gegenüber dem entzündungsfördernden Zytokin Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) eine signifikante Beeinträchtigung der Barriere nach. Diese Ergebnisse belegen, dass die EVOM™ Chip-Plattform eine hochempfindliche, standardisierte und skalierbare Lösung ist, um subtile Veränderungen der Barriere und Entzündungsreaktionen in fortschrittlichen Zellkulturmodellen zu erfassen.
Einleitung
Barrierebildende Gewebe wie das Gefäßendothel und die BBB regulieren den molekularen Austausch und die Gewebehomöostase streng. Ihre Integrität ist daher ein zentraler Messwert in der Krankheitsmodellierung, der Wirkstoffforschung und der Toxizitätsprüfung. TEER ist eine weit verbreitete, nicht-invasive Methode zur Quantifizierung der Barrierebildung und zum Nachweis einer Barrierebeeinträchtigung. Die EVOM™ Chip-Plattform integriert eingebettete Elektroden in mikrophysiologische Systemformate und ermöglicht so empfindliche, reproduzierbare TEER-Messungen. Dadurch werden manuelle Schwankungen vermieden und eine kontinuierliche, freihändige Überwachung ermöglicht. EVOM™ Chip liefert in Echtzeit hochpräzise Einblicke in die Dynamik zellulärer Barrieren und schafft zugleich einen standardisierten Ansatz für TEER-Messungen.
Dieser Anwendungshinweis zeigt, wie die EVOM™ Chip-Plattform eingesetzt wird, um:
- Überwachung der Reifung der Endothelbarriere in Monokulturen humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) durch freihändige, multiplexierte TEER-Messung auf dem Chip.
- Bewertung der BBB-Entwicklung in einem primären Tri-Kulturmodell auf der SynBBB-Plattform.
- Quantifizierung der durch Zytokine induzierten entzündlichen Barrierebeeinträchtigung mithilfe des TEER als Indikator für die funktionelle Beeinträchtigung
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Materialien und Methoden
HUVECs wurden auf EVOM™-Chip-Geräten kultiviert und über 48 Stunden auf die Bildung einer Barriere hin untersucht. Ein primäres BBB-Modell aus Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten wurde aufgebaut und 72-hours kultiviert, um die Entwicklung und Reifung der Barriere zu fördern. Nach der Ausbildung der Barriere wurden die Kulturen mit TNF-α (10 ng/mL) behandelt, um eine Barrierebeeinträchtigung hervorzurufen. Die Barriereintegrität wurde durch Quantifizierung des TEER-Werts auf der EVOM™-Chip-Plattform beurteilt, indem der elektrische Widerstand über die Zellbarriere gemessen wurde.
Statistische Analyse
Die Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. HUVEC-Monokultur, n = 7; SynBBB-Trikultur, n = 15. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Mehrfachvergleichen verwendet. Als Signifikanzschwelle wurde p < 0.05 festgelegt. Signifikanzniveaus: *** p < 0.001; **** p < 0.0001.
Ergebnisse
A. Der EVOM™ Chip quantifiziert die HUVEC-Barrierebildung und die zytokinvermittelte Störung. Die Widerstandswerte zu Beginn lagen im Durchschnitt bei etwa 15 kΩ. Nach 48 -hours Kultivierung stieg der TEER-Wert signifikant auf etwa 36 kΩ an, was auf die erfolgreiche Bildung einer dichten Endothelbarriere hinweist. Eine 4 -hours Exposition gegenüber TNF-α (10 ng/mL) verringerte den Widerstand auf etwa 29–30 kΩ und zeigte damit einen messbaren Verlust der Barriereintegrität.
- Die TEER-Werte haben sich während der Reifung der Monoschicht mehr als verdoppelt, was die rasche Ausbildung einer endothelialen Barriere mit hoher Integrität widerspiegelt.
- Die TNF-α-Exposition bewirkte einen schnellen und quantifizierbaren Abfall des TEER-Werts und zeigte damit, dass die Plattform einen akuten entzündungsbedingten Zusammenbruch der Barriere erfassen kann.
- Trotz der geringen Stichprobengröße wurden zwischen allen Versuchsgruppen statistisch signifikante Unterschiede beobachtet (n=7, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
Abb. 1 HUVEC-Monokultur auf der EVOM™-Chip-Plattform
B. Der EVOM™ Chip quantifiziert die komplexe BBB-Bildung und -Schädigung. Auf der SynBBB-Plattform wurden primäre BBB-Zellen in Trikultur kultiviert. Dabei zeigte sich eine fortschreitende Barriereausreifung: Der TEER-Wert stieg von etwa 14–15 kΩ zu Beginn auf etwa 25–26 kΩ nach 72- -hours Kultivierung. Nach der TNF-α-Exposition sank der Widerstand auf etwa 21–22 kΩ, was auf eine Beeinträchtigung der BBB-Integrität hinweist.
- Das primäre Trikulturenmodell zeigte über 72-hours eine physiologisch relevante Stärkung der BBB, im Einklang mit koordinierten Interaktionen zwischen Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten.
- Die Zytokinbelastung führte zu einer deutlichen Abnahme des TEER-Werts und bestätigte damit die Reaktionsfähigkeit des Modells auf entzündlichen Stress sowie die Empfindlichkeit der Plattform gegenüber subtilen BBB-Störungen.
- Zwischen allen Zeitpunkten wurden statistisch signifikante Unterschiede beobachtet (n=15, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
Diskussion
Eine genaue und quantitative Messung der Barriereintegrität ist für die Untersuchung der Gefäßbiologie und die Modellierung neurovaskulärer Krankheitsmechanismen von entscheidender Bedeutung. Die direkte Integration von TEER in Organ-on-Chip-Systeme durch die integrierte Elektrodenarchitektur von WPI bietet einen entscheidenden Vorteil gegenüber herkömmlichen Handsonden, die manuell positioniert werden müssen, zu Abweichungen zwischen Bedienenden führen und bei jeder Messung die Kulturbedingungen stören. Die integrierten Elektroden bleiben im Gerät fixiert und ermöglichen eine kontinuierliche, freihändige, nicht-invasive Überwachung mit gleichbleibender Elektrodengeometrie und hervorragender Signalstabilität, die für die Erkennung subtiler Veränderungen der Barrierefunktion entscheidend ist. Sowohl in endothelialen Monokulturen als auch in Trikulturen erfasste dieser Ansatz deutliche TEER-Anstiege während der Barriereausreifung und rasche Abfälle nach einer Entzündungsstimulation. Dies zeigt, wie wichtig die Integration von TEER als funktioneller Echtzeit-Messgröße ist. Die direkte Integration der TEER-Messung in die Kulturplattform gewährleistet eine höhere Datenqualität, bessere Reproduzierbarkeit und eine genauere Interpretation der Barriedynamik als Reaktion auf biologische oder pharmakologische Reize.
Hier zeigen wir, dass der EVOM™ Chip TEER-Anstiege, die die Barriereausreifung widerspiegeln, sowohl in Monokultur- als auch in Trikultur-Zellmodellen auf SynBBB-Mikrofluidik-Chips mit hoher Empfindlichkeit erkennen und außerdem die Wirkung von Zytokinen bei der Auslösung einer Entzündungsreaktion und der Schädigung der BBB quantifizieren kann. In beiden Modellen wurde nach der TNF-α-Behandlung ein Rückgang des TEER beobachtet, was mit einer zytokinvermittelten Störung der Tight-Junction-Struktur und einer erhöhten Permeabilität der Barriere übereinstimmt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die EVOM™ Chip-Plattform eine empfindliche, reproduzierbare und nicht-invasive Methode zur Überwachung der Barriedynamik in einer Reihe von in vitro-Modellen bietet. Diese Technologie schafft die Grundlage für standardisierte TEER-basierte Messwerte in organspezifischen Barriere-Modellen und ermöglicht Anwendungen beim Wirkstoff-Screening [ieinschließlich Hochdurchsatz-Screenings mit dem
Diese Ergebnisse bestätigen, dass die EVOM™ Chip-Plattform sowohl die Barrierebildung als auch die durch Zytokine verursachte Barrierefunktionsstörung in endothelialen Monokulturen und BBB-Trikulturen mit hoher Empfindlichkeit erkennen kann.
