Häufig gestellte Fragen zur TEER-Messung

Hier sind einige häufig gestellte Fragen (FAQ) zur TEER-Messung mit einem EVOM2.

Von Subhra Nag, PhD

Sind der elektrische Widerstand und der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) dasselbe?

Nein. Den TEER-Wert erhalten wir, indem wir den rohen/erhaltenen Widerstandswert auf einem epithelialen Voltmeter (z. B. EVOM2) mit der Zellwachstumsfläche multiplizieren (z. B. Fläche einer auf einem Zellkultur-Insert gewachsenen Zellmonolage).

Zum Beispiel, wenn Sie Zellen auf einem Zellkultur-Insert mit einer Fläche von 0,5 cm² züchten.

Die Widerstandsanzeige auf einem epithelialen Voltmeter (z. B. EVOM2) zeigt einen Wert von 300 Ω.

TEER = 300 Ω × 0,5 cm² = 150 Ω·cm²

Was ist ein EndOhm?

Das EndOhm ist eine Kammer, die für das EVOM2 entwickelt wurde, in die Sie eine herausnehmbare Vertiefung einsetzen, um die Widerstandsmessungen durchzuführen. Diese Kammer hat Elektroden in festen Positionen, und die Positionierung und Stabilität der Elektroden hat einen großen Einfluss auf die Messung des Gewebewiderstands.

Wie wird ein EVOM2 zur Messung der Konfluenz verwendet?

Das EVOM2 arbeitet nach dem Prinzip, dass die erste Messung des sogenannten „Blanko“-Brunnens die Summe aus Elektrodenwiderstand, Elektrodenabstand und dem Widerstand aufgrund des Volumens und der Molarität des flüssigen Mediums enthält. (Jegliche Ladungsunterschiede der Elektroden werden durch die Messmethode des EVOM2, die Polarität umzukehren und die Ergebnisse zu mitteln, aufgehoben.) Die nachfolgenden periodischen Messungen des Brunnens stellen das Wachstum der Membran durch eine Widerstandsmessung dar, und sobald dieser Widerstandsverlauf ein Plateau erreicht, kann man sagen, dass die Membran konfluente ist. Das EVOM2-System funktioniert ähnlich wie ein Spannungsklemmenverstärker und das Ussing-System, jedoch ohne die spezielle Ussing-Kammer. Das EVOM2-System ist nicht so genau wie ein Ussing-System, aber der Zweck des EVOM2-Systems ist es, festzustellen, ob eine Membran konfluente ist, nicht eine detaillierte Analyse durchzuführen. (Einige Membranpermeabilitätsanalysen können mit dem EVOM2-System als prozentuale Veränderung und nicht als absoluter Wert untersucht werden.)

Warum sollte man ein EndOhm statt eines STX verwenden?

Das EVOM2 erkennt vor allem Löcher und Lücken in der Membran, da der elektrische Strom den Weg des geringsten Widerstands sucht. Die STX2-Allzweckelektroden können sich biegen und den Elektrodenabstand verändern, und auch das Nicht-Festhalten in einem Brunnen kann zu erheblichen Widerstandsfehlern führen. Andererseits sind die Elektroden des EndOhm fest positioniert. Bei richtiger Pflege und Vorbehandlung im Medium liefern sie die stabilsten, reproduzierbarsten und zuverlässigsten Widerstandsmessungen. Die zusätzlichen zentrierten konzentrischen Elektroden sorgen außerdem dafür, dass die gesamte Membranfläche dem elektrischen Stromfluss ausgesetzt ist, sodass es keine Schattenbereiche durch Randplatzierung gibt, wie es bei den STX2 der Fall sein kann. (Es sei angemerkt, dass der erwartete Baseline-TEER-Wert des Gewebes, wenn er niedrig ist, Messschwierigkeiten bei großen Membranflächen verursachen kann. Zum Beispiel: Wenn der TEER-Wert 200 Ω·cm² beträgt, ist der Wert in einem 12-mm-Brunnen für dieselbe konfluente Messung um den Faktor 1,13 niedriger (176,9 Ω). Derselbe 200 Ω-Wert in einem 24-mm-Brunnen ist um den Faktor 4,52 niedriger oder 44,2 Ω. Wenn dieser Widerstandswert unter etwa 100 Ω fällt, sehen wir mehr Elektrodeninstabilität und die Messwerte können variieren. Wir haben festgestellt, dass Elektrodenreinigung und Vorbehandlung für stabile Messwerte unerlässlich sind.)

Wie reinige ich meine Elektrode?

Die Elektrodenreinigung besteht aus der periodischen Verwendung eines enzymatischen Reinigers (Enzol, Tergazyme) und/oder einem Einweichen in unparfümiertem Haushaltsbleichmittel (3 % NaClO). Das Bleichmittel dient dazu, Ag-Oberflächen wieder mit AgCl zu beschichten und angesammelte Proteine aufzulösen. Beide Effekte führen zu Elektrodeninstabilität. Der enzymatische Reiniger ist ein sicheres Mittel, um Rückstände von Elektroden zu entfernen, die durch Medienbestandteile wie DMEM abgelagert wurden. Wenn sich diese ansammeln, steigt der Widerstandswert und kann instabil werden.

Was ist mit der Elektrodenvorbehandlung?

Die Elektrodenvorbehandlung besteht darin, die Elektroden vor der Messung in das Messmedium einzutauchen, um Fremdflüssigkeiten aus den durchlässigen Pellets herauszuziehen. Alkohol wird häufig zur Sterilisation dieser Elektroden verwendet, und der Alkohol dringt in sie ein und wirkt als hoher Widerstand gegen den elektrischen Stromfluss. Während der Alkohol langsam mit salinbasiertem Medium im Inneren der Elektrode ausgetauscht wird, zeigt sich der Widerstandswert als abwärts driftender Wert.

Können Sie mir ein einfaches Datenerfassungssystem für TEER empfehlen?

Das Lab-Trax-4 ist ein leises, 12-Bit, vierkanaliges Analog-Digital-Datenaufzeichnungsgerät mit Abtastraten von bis zu 10.000 Proben pro Sekunde oder 2500 s/S für alle vier Kanäle. Dieses Gerät wird direkt über den USB2-Anschluss mit Strom versorgt und kann als tragbares Gerät auf einem Laptop im Feld verwendet werden. Die Hardware verfügt über vier digitale Eingänge und vier digitale Ausgänge, falls benötigt.

Die LabScribe3-Software ist benutzerfreundlich und wird regelmäßig aktualisiert, um den aktuellen Anforderungen gerecht zu werden. Da Microsoft weiterhin neue Betriebssysteme herausbringt, wird die Hardware auch von neueren Versionen von LabScribe unterstützt. Sie wird jetzt auch auf Mac- und Linux-Computern unterstützt. Wenn Sie ein STX2 für diese Messungen verwenden, benötigen Sie möglicherweise eine zusätzliche Hand, um Texteingaben vorzunehmen. Wenn Sie Ihren Text vor der Messung im Feld „Marks“ eingeben, müssen Sie nur die Eingabetaste drücken, um die Markierung zu setzen, wenn Ihr TEER-Wert stabil ist. Wenn Sie ein STX100 verwenden, haben Sie die Hände frei, um Notizen zu machen.

Welche Herausforderungen können bei der TEER-Messung auftreten?

Dies wurde geschrieben, um Probleme mit dem STX2 anzusprechen, gilt aber auch für das EndOhm.

Folgende Punkte können den Widerstandswert verändern:

• Elektrodenabstand. Vermeiden Sie es, den Elektrodenabstand des STX2 zu spreizen oder zu komprimieren.
• Elektrodenwiderstand. Halten Sie die Elektroden sauber und vorbehandelt.
• Elektrodentiefe. Tauchen Sie die Elektroden immer mindestens 2 mm ein.
• Elektroden in der Nähe der Kunststoffwände. Versuchen Sie, die Elektroden möglichst von den Plattenwänden fernzuhalten.
• Elektrodenplatzierung. Wenn Sie normalerweise das längere Bein der Elektrode auf der Bodenplatte ablegen, wiederholen Sie diese Platzierung für Konsistenz.
• Flüssigkeitswiderstand. Lassen Sie das Medium nicht verdunsten und verdünnen Sie es nicht.
• Flüssigkeitsstände. Versuchen Sie, bei jeder Messung das gleiche Flüssigkeitsvolumen zu halten. Kleine Variationen können in kleinen Inserts große Auswirkungen haben.
• Übermäßige Bewegung. Versuchen Sie, die Elektroden ruhig zu halten. In manchen Fällen kann ein mechanischer Elektrodenhalter verwendet werden.
• Waschen/Medienwechsel kann zu Rissen in der Membran des Zellkultur-Inserts führen. Der Flüssigkeitswechsel sollte vorsichtig entlang der Wand der Inserts erfolgen. Eine kleine Lücke zwischen Gewebe/Zellschicht und Membran des Zellkultur-Inserts kann einen klaren Weg für das EVOM2 öffnen, um einen niedrigeren Widerstand zu messen. Der Strom fließt durch diese Lücke und nicht durch die Membran mit der Zellmonolage, da Elektrizität den Weg des geringsten Widerstands nimmt. In solchen Fällen bemerken Sie einen drastischen Abfall des Widerstands. Wenn Sie einen so großen Widerstandsabfall feststellen, empfehlen wir, Ihre Probe (z. B. Zellmonolage auf einem Zellkultur-Insert) unter dem Mikroskop zu überprüfen, um zu sehen, ob ein Riss im Filter oder eine große leere Region auf dem Filter vorliegt, die darauf hinweist, dass eine Zellgruppe sich gelöst hat.

Mehrere Messungen im selben Brunnen (3-5 Mal) durchzuführen und den Durchschnitt zu berechnen, kann die Variabilität verringern.

Können Sie einige experimentelle Parameter vorschlagen, die kontrolliert werden können, um konsistente TEER-Ergebnisse zu erhalten?

• Die Temperatur beeinflusst die TEER-Werte. Wir empfehlen, eine konstante Temperatur einzuhalten, um konsistente Werte zu erhalten. Da die Messungen in Zellkulturmedium/Puffer erfolgen, empfehlen wir die Verwendung eines Wasserbads mit fester Temperatur, um das Medium/Puffer während des Experiments zu erwärmen. Eine konstante Medium-/Puffertemperatur gewährleistet konstante experimentelle Bedingungen. Wir empfehlen, die Wellplatte mit den auf Kulturinserts gewachsenen Zellen mindestens 20 Minuten vor der Messung aus dem Inkubator zu nehmen, damit sie sich auf Raumtemperatur stabilisieren kann.
• Wenn Sie eine EndOhm-Kammer verwenden, stellen Sie sicher, dass der gleiche feste Abstand zwischen den oberen und unteren Elektroden eingehalten wird, um konsistente Messwerte zu erhalten. Wenn Sie eine Stäbchenelektrode (STX2) verwenden, versuchen Sie, sie während der Messung vertikal zu halten. Konsistenz bei der Haltung der Stäbchenelektroden während eines Experiments führt zu konsistenten Messwerten.
• Wir empfehlen, dieselbe Flüssigkeit mit derselben Ionenstärke sowohl auf der apikalen Seite (z. B. oben auf einem Zellkultur-Insert) als auch auf der basolateralen Seite (z. B. unterer Teil des Zellkultur-Inserts, das in einem Brunnen einer 12-Well-Platte sitzt) zu verwenden. Wenn Sie während der Messung 1X PBS-Puffer auf der apikalen Seite verwenden, empfehlen wir auch 1X PBS-Puffer auf der basolateralen Seite. Außerdem empfehlen wir, dass die Flüssigkeitsstände (innerhalb und außerhalb der Zellkultur-Inserts) auf gleicher Höhe sind, um Druckunterschiede zu minimieren. Während der Experimente wird die apikale Vertiefung/Seite zuerst mit Flüssigkeit gefüllt, um ein Ablösen der Membran vom Filter durch hydrostatischen Druck zu verhindern.
• Die Anwendung konsistenter Flüssigkeitsvolumina (Medium/Puffer) während aller Experimente reduziert die Datenvariabilität.

Für weitere Informationen siehe Aufzeichnung von TEER-Messungen mit einem EVOM2.

HINWEIS: Das EVOM2 wurde durch das EVOM™ Manual ersetzt, und das Ussing-System wurde eingestellt.