Die Erforschung der intrazellulären Welt
Beitragender Autor: Dr. Steve Andre (Muskelphysiologe)
Alle lebenden Zellen erhalten eine elektrische Ladungsdifferenz zwischen den Lösungen auf der Innen- und Außenseite der Zellmembranen aufrecht. Die Spannung über die Zellmembran liegt normalerweise auf einem stabilen Niveau, das als Ruhemembranpotenzial bekannt ist. Das Ruhemembranpotenzial entsteht durch die unterschiedliche Verteilung von Ionen auf beiden Seiten der Membran. In Muskelfasern ist die Kaliumkonzentration innerhalb der Zelle über 50-mal höher als die Ionenkonzentration in der extrazellulären Flüssigkeit. Andererseits ist die Natriumkonzentration außerhalb der Membran zehnmal höher als innen. Der Konzentrationsgradient von Kalium ist größer und verläuft in die entgegengesetzte Richtung zum Natriumkonzentrationsgradienten. Die Ionenkonzentrationen werden durch drei Faktoren bestimmt:
- Natrium-Kalium-Pumpe
- Relative Diffusionsraten dieser Ionen entlang der Konzentrationsgradienten
- Anziehung und Abstoßung entgegengesetzter und gleicher Ladungen
Natrium/Kalium-Pumpe
Die Natrium-Kalium-Pumpe transportiert aktiv Natrium aus der Zelle heraus und Kalium in die Zelle hinein. Die Zelle hat natürlicherweise mehr K+ außerhalb der Zelle und Na+ innerhalb der Zelle. Die Pumpe stellt die Konzentrationsgradienten dieser beiden Ionen über die Zellmembran her und erhält sie aufrecht. Die Konzentrationsgradienten bilden eine ionische Batterie über die Membran, und die Natrium-Kalium-Pumpe hält diese Batterie geladen. Um eine Animation dieses Prozesses anzusehen, siehe:
Das Ruhemembranpotenzial, das bei den meisten Zellen zwischen -50 und -90 mV liegt, entsteht durch die Diffusion von Kalium. Aufgrund seines großen Konzentrationsgradienten diffundiert Kalium schneller über die Membran als jedes andere Ion. Wenn Kalium aus einer Zelle diffundiert:
- Entstehen überschüssige negative Ladungen innerhalb der Zelle
- Ziehen extrazelluläre Kaliumionen negative Ionen nach sich
- Drücken extrazelluläre Kaliumionen positive Ionen auf der Außenseite zurück in die Zelle.
Da diese anderen Ionen relativ geringe Permeabilitäten haben, bewegen sie sich nicht so schnell wie die Kaliumionen. Daher haben diese anderen Ionen nur einen geringen Einfluss auf die Neutralisierung des negativen Potenzials innerhalb der Zelle. Die Netto-Bewegung des Kaliums wird auch durch die Potenzialdifferenz begrenzt, die sich zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Zelle aufbaut. Die Negativität innerhalb der Zelle hält die positiven Kaliumionen zurück. Im Gleichgewicht wird ein Kaliumion durch eine chemische Kraft (Konzentrationsgradient), die die gleiche Stärke hat wie die elektrische Kraft (negatives Potenzial), die das Ion zurück in die Zelle zieht, durch einen Kanal aus der Zelle gedrückt. Das Membranpotenzial hängt von den Konzentrationen der verschiedenen Ionen über die Membran und der relativen Permeabilität der Membran für diese Ionen ab.
Glas-Mikroelektroden
Ruhemembran-, Aktions-, langsame Rezeptor- und synaptische Potenziale werden mit einem intrazellulären Elektrometer wie dem Duo773 von WPI gemessen, wobei feine, mit Flüssigkeit gefüllte Glas-Mikropipetten verwendet werden, die als Mikroelektroden bekannt sind.
Mikroelektroden-Verstärker
Es ist entscheidend, dass die Impedanz der Zelle, der Mikroelektrode und des Verstärkers richtig aufeinander abgestimmt sind. Andernfalls kann das Signal verloren gehen. Um die Amplitude des Signals zu erhalten, wird ein Hochimpedanz-Gleichstromverstärker, bekannt als intrazelluläres Elektrometer oder Mikroelektroden-Verstärker, wie der Duo773 von WPI, in der Schaltung zwischen der Mikroelektrode und der Aufzeichnungseinheit verwendet.
Dieser Verstärker passt die Impedanz der Mikroelektrode an die Eingangsimpedanz der Aufzeichnungseinheit über eine Schaltung an, die als Spannungsfolger bekannt ist. Elektrometer haben üblicherweise Eingangsimpedanzen, die gleich oder größer als 1010Ω sind. In der Regel sollte die Eingangsimpedanz eines Elektrometers mindestens 100-mal größer sein als die Impedanz der Mikroelektrode, die für die Aufzeichnung verwendet wird. Die kleine Querschnittsfläche der Mikroelektrodenspitze reduziert den Stromfluss durch die Elektrode erheblich. Daher sagt man, dass diese Art von Elektrode eine hohe Impedanz hat. Das bedeutet, dass das Messen von Potenzialen aus kleineren Zellen mit Mikroelektroden mit kleineren Spitzen und höheren Impedanzen den Einsatz von Elektrometern mit höheren Eingangsimpedanzen erfordert.
Neben hohen Eingangsimpedanzen haben Elektrometer niedrige Ausgangsimpedanzen, die besser zu den niedrigen Eingangsimpedanzen der Aufzeichnungseinheiten passen. Das bedeutet, dass die tatsächlichen Amplituden der mit Elektrometern aufgezeichneten Membranpotenziale die Amplituden sind, die von den Aufzeichnungsgeräten angezeigt werden. Da diese Signale wenig oder keine Verstärkung benötigen, benötigen Elektrometer nur Ausgangsverstärkungen von X1 oder X10.
Für normale Ruheaktionspotenziale (–50 bis –90 mV) verwenden Sie eine Verstärkung von X1. Für synaptische Potenziale, die üblicherweise im Bereich von 5-10 mV liegen, verwenden Sie eine Verstärkung von X10.
HINWEIS: Elektrometer nehmen Störungen durch elektrische Strahlung nicht so leicht auf wie andere Verstärkertypen.
Ein hochwertiges intrazelluläres Elektrometer verfügt über einige Funktionen, wie eine Kondensatorkompensationsschaltung und einen „Tickler“.
Kondensatorkompensator
Die Kondensatorkompensationsschaltung, auch als Brücke bekannt, neutralisiert die Wirkung der Zellmembran, die normalerweise als Kondensator wirkt, indem sie eine Ladung hält. Wenn ein elektrischer Impuls in eine Zelle injiziert wird, haben die injizierten Rechteckwellen abgerundete Ecken, weil die Zellmembran den injizierten Strom dämpft. Die Verwendung einer Kondensatorkompensationsschaltung schärft die Ecken der injizierten Rechteckwelle, indem sie die Zellmembran depolarisiert. Das Endergebnis der Verwendung einer Kondensatorkompensationsschaltung ist ein effektiverer injizierter Impuls. Die injizierten Aktionspotenziale führen zu einer schnelleren Reaktionszeit und einer aufgezeichneten Welle, die der injizierten entspricht. Die Kondensatorkompensationsschaltung subtrahiert die Wirkung der Zellmembran auf das injizierte Potenzial.
Tickler
Der Tickler sendet einen schnellen, scharfen Stromimpuls durch die Mikroelektrode. Auch als „Ringer“ bekannt, hat der Tickler zwei Zwecke. Wenn die Mikroelektrode außerhalb einer Zelle ist, kann der Tickler verwendet werden, um die Spitze der Elektrode zu reinigen. Wenn die Mikroelektrode gegen die Zelle gedrückt wird, sodass eine kleine Delle in der Zelle entsteht, hilft das Betätigen des Ticklers der Mikroelektrode, die Zellmembran zu durchdringen.
