ANWENDUNGSHINWEIS: TEER-Technologie ermöglicht einen optimierten in-vitro-Arbeitsablauf für die Wirkstoffforschung

Optimierter In-vitro-Arbeitsablauf zur Identifizierung von Verbindungen mit vasoaktiven Eigenschaften

In-vitro-Modelle verwenden zwei gängige Methoden, um Veränderungen der Integrität der endothelialen Barriere zu quantifizieren: transepitheliale/transendotheliale elektrische Resistenz (TEER) und Permeabilität von Tracerverbindungen.¹ TEER ist eine nicht-invasive Methode, die Veränderungen der elektrischen Leitfähigkeit misst, um die Konfluenz und Barriereintegrität zu bestimmen. Die Permeabilität von Tracerverbindungen nutzt Moleküle mit definiertem Molekulargewicht, um die Ausschlusskapazität von Zellbarrieren zu messen (z. B. 4 kDa FITC-Dextran oder FD4).¹ Unter Verwendung des EVOM™ Manual (EVOM-MT-03-01) mit der EndOhm TEER-Elektrode und permeablen Zellkulturträgern beschreibt diese Anwendungshinweis, wie die Integrität der endothelialen Barriere nach Zytokinbehandlung nicht-invasiv bewertet werden kann und bietet eine Methode zur Identifizierung vasoaktiver Verbindungen, die potenziell vaskuläre Schäden verursachen können. Studien zur Permeabilität von Tracerverbindungen werden mit TEER-Bewertungen kombiniert, um die durch Behandlung induzierten Auswirkungen sowohl auf interzelluläre Verbindungen als auch auf den parazellulären Transport zu erläutern (Abb. 1).

Abb. 1 – Arbeitsablauf zur Messung der endothelialen Aktivierung mittels TEER- und Tracer-Permeabilitäts-Assays.

Durch Medikamente induzierte vaskuläre Schäden (DIVI) treten auf, wenn vasoaktive Verbindungen das endotheliale Gefäß und die umliegende glatte Muskulatur schädigen, was zu Entzündungen und der Entwicklung vaskulärer Läsionen führt.² DIVI ist schwer vorherzusagen und kann durch Medikamente aus verschiedenen Klassifikationen und krankheitsspezifischen Kategorien ausgelöst werden.³ Die durch DIVI bedingte Medikamententoxizität betrifft etwa 2,5 % der neuen Arzneimittelkandidaten, weshalb die frühzeitige Identifizierung vasoaktiver Verbindungen für die präklinische Arzneimittelentwicklung entscheidend ist.⁴

Die Aktivierung von Endothelzellen (EC) ist ein wichtiger Vorläuferschritt bei DIVI.⁵ ECs nehmen diesen proinflammatorischen Phänotyp als Reaktion auf Krankheiten (z. B. Sepsis, virale hämorrhagische Fieber), Zytokine, äußere mechanische Kräfte oder Medikamentenbehandlung an.⁶ Die Aktivierung der ECs schädigt und verändert die Integrität des endothelialen Gefäßes, was zu Veränderungen der vaskulären Permeabilität, des Vasomotortons und der Biomarkerausprägung (z. B. E-Selectin, P-Selectin, ICAM1, VCAM1) führt.⁷ Die vaskuläre Permeabilität wird durch ein System interzellulärer Verbindungen kontrolliert, zu denen Tight Junctions (TJs) und Adherens Junctions (AJs) gehören.⁸ Diese Protein-Protein-Interaktionen bilden eine selektiv permeable Barriere, die den parazellulären Transport unterstützt und die vaskuläre Integrität aufrechterhält.⁹ Wenn Endothelzellen als Reaktion auf die Behandlung mit vasoaktiven Verbindungen aktiviert werden, können sich aufgrund von Veränderungen in der Organisation der Tight-Junction-Proteine fokale endotheliale Lücken bilden. Diese Lücken verändern die Barriereintegrität und die Porengröße der interzellulären Verbindungen, was zu einer dysregulierten endothelialen Permeabilität oder vaskulärer „Leckage“ führt.⁸

Um ein In-vitro-Modell zur Messung der Aktivierung von Endothelzellen zu etablieren, wurden humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) mit einer Dichte von 6 x 10⁴ Zellen/cm² in Zellkultur-Insertplatten ausgesät (Abb. 1). Die TEER wurde mit dem EVOM™ Manual und der EndOhm TEER-Elektrode über mehrere Tage gemessen, bis die Konfluenz erreicht war. Konfluente HUVECs wurden entweder mit 10 oder 50 ng/ml TNF-alpha für 24 Stunden behandelt und mittels TEER gemessen. Ein fluoreszenter Tracer (4 kDa FITC-Dextran) wurde für 1 Stunde in die apikale Kammer gegeben, und die Menge des Tracers in der basolateralen Kammer wurde mit einem Plattenleser (Ex/Em 495/535) gemessen.

Abb. 2 – TEER- und fluoreszenzbasierte Tracer-Permeabilitätsergebnisse für mit TNF-alpha behandelte HUVECs.

Das EVOM™ Manual mit der EndOhm TEER-Elektrode zeigte eine Abnahme der HUVEC-TEER nach 24-stündiger TNF-alpha-Behandlung, wobei die niedrigeren TEER-Werte für beide Dosen von 10 und 50 ng/ml ähnlich waren (Abb. 2A). Die Permeabilitätsanalyse mit einem fluoreszenten Tracer zeigte, dass HUVECs, die mit 50 ng/ml TNF-alpha behandelt wurden, zu diesem Zeitpunkt durchlässiger für den fluoreszenten Tracer waren als die mit 10 ng/ml behandelten Zellen (Abb. 2B). Die Permeabilität parazellulärer Tracer wie FITC-Dextran hängt von der Porengröße der Tight Junctions und dem parazellulären Wasserfluss ab, während TEER-Werte von der ionischen Leitfähigkeit beeinflusst werden.¹ HUVECs, die mit TNF-alpha behandelt wurden, zeigen Veränderungen in der Ausschlusskapazität der Tight Junctions (Permeabilität; Abb. 2B) sowie Veränderungen im parazellulären Transport (TEER; Abb. 2A). Zusammen zeigen diese Daten, wie das EVOM™ Manual mit der EndOhm-Elektrode in Kombination mit Permeabilitäts-Tracer-Assays verwendet werden kann, um die Auswirkungen von Zytokinen auf interzelluläre Verbindungen und Veränderungen des endothelialen Aktivierungszustands zu bewerten.

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Literaturverzeichnis

1. Felix K, Tobias S, Jan H, Nicolas S, Michael M. (2021) Histochem Cell Biol. 156(6):609-616. PMID 34459960
2. Yaseen K, Nevares A, und Tamaki H. (2022) Curr Rheumatol Rep. 24(11):323-336. PMID 36129631
3. Zhang J, Hanig JP, und De Felice AF. (2012) Vascul Pharmacol. 56(1-2):14-25. PMID 21968053
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