Ca2+-Nachweis im Muskelgewebe mittels Fluoreszenzspektroskopie

Der Einsatz fluoreszierender Sonden in der Zellphysiologie hat sich in den letzten Jahren als unverzichtbares Werkzeug zur Analyse der Zellfunktion etabliert. Die physikalischen Grundlagen der Fluoreszenz werden durch das Elektronenzustandsdiagramm (sogenanntes Jablonski-Diagramm, siehe Abb. 1) veranschaulicht, das den dreistufigen Prozess zur Erzeugung des Fluoreszenzsignals (Anregung – angeregter Zustand/Lebensdauer – Fluoreszenzemission) in einem Fluorophor/Indikator zeigt und im Folgenden vereinfacht beschrieben wird.

jablonski diagram

Abb. 1 – Jablonski-Diagramm, das die Prozesse der Fluoreszenz durch Absorption höherer Photonenenergie durch ein Fluorophor und die anschließende Emission niedrigerer Photonenenergie zeigt, was während der Fluoreszenzlebensdauer zur Fluoreszenz führt.

Fluoreszenz entsteht, wenn ein Anregungsphoton (hν_EX) aus einer externen Quelle, wie einer Hochleistungs-LED, von einem Fluorophor absorbiert wird, das dadurch seine Energie anhebt (S1’). Während der Fluoreszenzlebensdauer zerfällt die erhöhte Energie (S1’) in einen niedrigeren Energiezustand S1. Anschließend resultiert die Fluoreszenz in der Emission eines Photons mit geringerer Energie (hν_EM) und somit längerer Wellenlänge. Grundlegend in der Spektroskopie ist der Energie- oder Wellenlängenunterschied, dargestellt durch (hν_EX-hν_EM), der als Stokes-Verschiebung bezeichnet wird. Die Stokes-Verschiebung ermöglicht eine effiziente Trennung der Anregung, wodurch Fluoreszenz eine sehr empfindliche Technik ist, die gegen einen niedrigen Hintergrund nachweisbar ist und von Anregungsphotonen isoliert werden kann.

Stokes-Shift

Abb. 2 – Typisches Anregungs-Emissions-Diagramm, das das Absorptionsspektrum eines Moleküls bei kürzerer Wellenlänge (d.h. höherer Energie) von einer entsprechenden Anregungsquelle und das resultierende Fluoreszenzspektrum des emittierten Lichts bei längerer Wellenlänge (d.h. niedrigerem Energiezustand) zeigt.

Vier wesentliche Elemente der Fluoreszenzsignalisierung können dann identifiziert werden, um ein Detektionssystem aufzubauen:

Anregungslichtquelle, angepasst an die Absorptionsbandbreite des Fluorophors (z. B. Hochleistungs-LED mit spezifischer Wellenlänge)
Ein Fluorophor/Indikator (z. B. Fura-8 zur Detektion von freiem Ca²⁺ im Muskelgewebe)
Emissionswellenlängenfilter zur Begrenzung der Bandbreite der Emissionsphotonen oder überlappender Bänder
Ein Detektorsystem, das das Fluoreszenzlicht registriert und ein aufzeichnungsfähiges Ausgangssignal als elektrisches Signal erzeugt (z. B. Photomultiplier-Röhren).

Unabhängig von der Anwendung ist die Kompatibilität dieser vier Elemente entscheidend für die Optimierung der Fluoreszenzdetektion.

Beispiel für die Detektion von freiem Ca²⁺ im Muskelgewebe

Typischerweise wird ein fluoreszierender Farbstoff in Gewebe oder einzelne Zellen eingebracht, um eine fluoreszierende Reaktion des markierten Moleküls zu erhalten. Ein typisches Beispiel ist die Detektion des transienten Anstiegs der zytoplasmatischen/myoplasmatischen freien Kalziumkonzentration (Δ[Ca²⁺]) als intermediäres Signalereignis der Erregungs-Kontraktions-Kopplung. Die Quantifizierung von Δ[Ca²⁺] erfolgt durch monochromatisches Licht, das den farbstoffmarkierten Ca²⁺-Molekül in einer Gewebe-/Zellprobe entweder in einem Gewebebad oder einem mikroskopischen Versuchsaufbau anregt. Das emittierte Fluoreszenzsignal des Indikatorfarbstoffs kann dann verwendet werden, um Amplitude und Zeitverlauf der Δ[Ca²⁺] mit empfindlichen Detektoren wie hochempfindlichen Photomultiplier-Röhren (PMT-Modul) oder Kameras zu überwachen.

Der ratiometrische Indikatorfarbstoff Fura-8™ eignet sich gut zur Detektion von Δ[Ca²⁺] Transienten. Fura-8™ wird bei 365 nm und 410 nm Wellenlängen angeregt, und die Emission wird bei 525 nm Wellenlänge im Dual-Anregungs/Einzel-Emissions-Modus, d.h. ratiometrischer Messung, aufgezeichnet. Die Vorteile dieser ratiometrischen Messtechnik sind:

Minimierung von Bewegungsartefakten
Ausgleich möglicher Effekte ungleichmäßiger Beladung
Inhomogene Verteilung des Fluoreszenzindikators in den Zellen
Bleichung des Indikatorfarbstoffs bei der Detektion von Δ[Ca²⁺] Transienten im Muskelgewebe.

Dies ermöglichte die Quantifizierung und den Vergleich zwischen:

Techniken mit hoher räumlicher versus hoher zeitlicher Auflösung an menschlichen linken Ventrikelschnitten
Der Möglichkeit, freie Kalziumkonzentrations-Δ[Ca²⁺] Transienten in einem horizontalen Gewebebad an menschlichen linken Ventrikelschnitten oder murinen Schnitten zu messen.

Abb. 3 – Qualitative Darstellung einiger Ergebnisse der freien Ca²⁺-Detektion in menschlichen Herzschnitten mit dem SI-BF-100-System.

Durchschnittliche Fluoreszenzintensitäten von Fura-8-beladenen menschlichen linken Ventrikelschnitten, detektiert bei 525 nm, wenn sie bei 340 nm bzw. 410 nm angeregt werden, und berechnete Verhältnisse (untere Kurve) aus den Bildgebungsdaten einer Rolera EM-C²-Kamera (links). Rechts die Reaktion des SI-BF-100, detektiert mit zwei Blenden-Einstellungen und berechneten Verhältnissen (untere Kurven). Außerdem werden fluoreszierende Daten gezeigt, die mit der kleinen Blendenöffnung aufgenommen und bei 50 Hz Tiefpass-gefiltert wurden. Beachten Sie den großen Zeitunterschied bei der Detektion des Fluoreszenzsignals zwischen den Bildgebungsdaten (Rolera EM-C²) und der SI-BF-100-Detektion (210 ms vs. 1 ms Intervall), was die Detektion schnell wechselnder Ca²⁺-Transienten ermöglicht (aus Belz et al., SPIE letters, 2016).

Literatur

Belz M., et. al. Faseroptischer Biofluorometer für physiologische Untersuchungen an Muskelschnitten. Proc. SPIE 9702, Optical Fibers and Sensors for Medical Diagnostics and Treatment Applications XVI, 2016.

Spektrophotometrie. Wikipedia, die freie Enzyklopädie, 2017 (Querverweise).