Automatisierung & Optimierung

Primäre humane Astrozyten (iXCells 10HU-035) wurden in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; 10-013-CM) aufgetaut, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS; 35-010-CV) ergänzt war, und auf Corning® BioCoat® Kollagen I-beschichteten Flaschen (354486) kultiviert. Ein Arbeitsvorrat kryokonservierter Zellen wurde nach dem Auftauen oder nach einer einzigen Passage in eine neue kollagenbeschichtete Flasche verwendet. Die Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y (ATCC®; CRL-2266) wurde in DMEM mit 10 % FBS kultiviert. hCMEC/D3 (MilliporeSigma; SCC066) wurden auf Corning® BioCoat® Kollagen I-beschichteten Flaschen in EBM-2 (Lonza; 3156) kultiviert, ergänzt mit EGM-2 MV (Lonza; 4147), zusätzlich 2,5 % FBS und 1 % chemisch modifiziertem Lipidkonzentrat (Thermo Scientific; 11905031).

Verschiedene Kombinationen von Einzel-, Ko- und Tri-Kulturen wurden unter Verwendung von 0,4 μm Corning® HTS Transwell®-24-Well Permeablen Trägern (3379) eingerichtet. Für Einsätze, die mit Astrozyten kultiviert wurden, wurde ein 50 μL Tropfen von 100 μg/mL Corning® Matrigel® Wachstumsfaktorreduzierter Basalmembran-Matrix, verdünnt in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 21-040-CM), auf die Unterseite des Einsatzes aufgetragen, indem die Platte auf ihren Deckel umgedreht wurde. Die Einsätze wurden für eine Stunde im Laminar-Flow-Schrank inkubiert, bevor die Lösung abgesaugt und anschließend Astrozyten ausgesät wurden. Astrozyten wurden mit Accutase® Zellablösungslösung (25-058-CI) geerntet und in DMEM mit 10 % FBS bei einer Dichte von 264.000 Zellen/mL resuspendiert. Ein 50 μL Tropfen der Zellen (75.000 Zellen/cm²) wurde jedem umgedrehten Einsatz hinzugefügt, und die Zellen durften eine Stunde anhaften, bevor die Platte wieder in die Standardkulturposition gedreht und die Einsätze mit 200 μL sowie die Empfänger-Wells mit 500 μL DMEM plus 10 % FBS befüllt wurden. Am selben Tag wurden Empfängerplatten (3524), die SH-SY5Y enthalten, mit Accutase® geernteten Zellen bei 10.000 Zellen/cm² in 500 μL DMEM mit 10 % FBS ausgesät. Astrozyten- und SH-SY5Y-Kulturen wurden etwa 72 Stunden getrennt inkubiert, bevor hCMEC/D3 hinzugefügt wurden. hCMEC/D3 wurden mit Accutase geerntet und in Einsätze mit oder ohne Astrozyten bei einer Dichte von 40.000 Zellen/cm² in 300 μL hCMEC/D3-Assay-Medium ausgesät. Das hCMEC/D3-Assay-Medium bestand aus EBM-2, ergänzt mit EGM (Lonza; 4133) ohne Rinderhirnextrakt, zusätzlich 3 % FBS und 1 % chemisch modifiziertem Lipidkonzentrat. Einsätze wurden mit Zellkulturplatten mit oder ohne SH-SY5Y-Zellen kombiniert, wobei 1 mL hCMEC/D3-Assay-Medium in der darunterliegenden Zellkulturplatte verwendet wurde. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. 48 Stunden nach Zugabe der hCMEC/D3 wurden einige Kulturen Scherbedingungen ausgesetzt, indem sie auf einem Corning® LSE™ Low Speed Orbital Shaker (6780-FP) bei 50 U/min platziert wurden. TEER wurde täglich nach Zugabe der hCMEC/D3-Zellen mit dem World Precision Instruments EVOM™ AUTO (EVA-MT-03-02) gemessen.

24 Stunden alte Monolagen wurden fixiert, indem das Medium abgesaugt und durch 500 μL 4% Paraformaldehyd (PFA; Boston BioProducts; BM-155) pro Einsatz und 1 mL pro Zellkulturplatte ersetzt wurde. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Einsätze mit dem gleichen Volumen PBS gewaschen. Die Monolagen wurden anschließend mit 0,1% Triton X (Integra Chemical Company; T756.30.30) für 15 Minuten permeabilisiert und erneut mit PBS gewaschen. Danach wurden die Monolagen über Nacht bei 2-8º C mit 2% Rinderserumalbumin (MilliporeSigma; A9576) in PBS blockiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit PBS gewaschen und die Monolagen wurden über Nacht bei 2-8º C mit 100 μL einer 1:1000 Verdünnung von ZO-1 (Invitrogen; 740002MP647) gefärbt.

Nach der Optimierung in Corning® HTS Transwell® 24-Well Permeable Supports wurde dasselbe Protokoll auf 0,4 μm Corning® HTS Transwell® 96 Permeable Supports (7369) angewendet, wobei nur die Bedingungen Astrozyten mit hCMEMC/D3 und SH-SY-5Y mit hCMEMC/D3 verwendet wurden. Die Matrigel-Beschichtung und die Volumina der Astrozyten-Besaatung auf der Unterseite der Einsätze wurden auf 22 μL pro Einsatz reduziert und die Konzentrationen angepasst, um dieselbe μg- oder Zellzahl pro cm² beizubehalten. Nach der Anheftung der Astrozyten wurden 100 μL DMEM mit 10 % FBS zu jedem Einsatz und 200 μL pro Empfänger-Well hinzugefügt. Zusätzlich wurden SH-SY-5Y-Zellen in Corning HTS Transwell-96 Empfängerplatten (3382) mit 200 μL pro Well ausgesät. Nach 48 Stunden Anheftung der hCMEC/D3 wurde auf alle Einsätze Scherung angewendet. Der TEER wurde täglich mit dem EVA-MT-03-01 Elektrodenarray gemessen.

Ungefähr 120 Stunden nach Zugabe von hCMEC/D3 wurde das Medium aus den Corning® HTS Transwell® 96 Permeable Supports abgesaugt und durch seriell verdünntes Lipopolysaccharid (LPS; Invitrogen; 00-4976-93), Insulin (Thermo Scientific; 12585014), TNF alpha (Thermo Scientific; 300-01A-500 μg) oder Medium als Negativkontrolle ersetzt. Die Verbindungen wurden 48 Stunden lang auf einem Schüttler mit den Kulturen inkubiert, wobei der TEER täglich gemessen wurde.

Abbildung 1: Scherkräfte erhöhen die Barriereintegrität der BBB. A. Nach fünf Tagen unter statischen Bedingungen, wenn Zellen auf Transwell-Platten ohne durch Schwerkraft erzeugte Scherkräfte kultiviert werden, zeigen hCMEC/D3-Zellen höhere TEER-Werte als Astrozyten, wenn hCMEC/D3-Zellen allein oder in Kombination mit Astrozyten und/oder Neuroblastomzellen (SH-SY5Y) kultiviert werden. B.

TEER ist eine zerstörungsfreie funktionelle Messmethode zur Analyse der Barriereintegrität, die verwendet werden kann, um Veränderungen an 2D- und 3D-Gewebemodellen zu überwachen und in vitro- und in vivo-Phänomene zu korrelieren.

Abbildung 2: ZO-1 Immunhistochemie zeigt eine Zunahme der Tight Junctions und der Blut-Hirn-Schranken-Integrität (BBB) von hCMEC/D3-Zellen unter Scherstress. Repräsentative Bilder verschiedener Zellkombinationen auf permeablen Trägern, kultiviert unter statischen (obere Reihe) oder Scherbedingungen (untere Reihe). Kulturen am Tag 8 fixiert. Bilder aufgenommen mit Leica Stellaris 5 Laser-Scanning-Konfokalmikroskop mit einem 40x/1,3 NA Öl-Immersionsobjektiv. Maßstab 20 μm.

Abbildung 3: BBB-Modelle, die in 96-HTS-Platten gezüchtet wurden, zeigen über 5 Tage eine Zunahme der Barriereintegrität und eine Abnahme der Permeabilität, gemessen durch TEER. Durchschnittliche TEER-Messungen von drei technischen Replikaten pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten nach Hintergrundsubtraktion von Transwells ohne Zellen (nur Medium). Daten werden mit Standardfehler dargestellt. Die statistische Analyse ergab p<0,05, wie mit * durch einen ungepaarten zweiseitigen t-Test angezeigt.Abbildung 4: LPS erhöht die BBB-Permeabilität. Einfluss von LPS. Durchschnittliche TEER-Messung von Kulturen, die 48 Stunden lang steigenden LPS-Konzentrationen ausgesetzt waren. Die Daten sind der Durchschnitt von drei technischen Replikaten pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten, dargestellt mit Standardfehler. ANOVA mit Dunnett-Post-Test im Vergleich zu nur Medium. *=p<0,05, **=p<0,005, ***=p<0,001, ****=p<0,0001.Einfluss von Insulin. Durchschnittliche TEER-Messung von Kulturen, die 48 Stunden lang steigenden Insulinkonzentrationen ausgesetzt waren. Die Daten sind der Durchschnitt von drei technischen Replikaten pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten, dargestellt mit Standardfehler. ANOVA mit Dunnett-Post-Test im Vergleich zu nur Medium. *=p<0,05, **=p<0,005, ***=p<0,001, ****=p<0,0001.Einfluss von TNF-α. Durchschnittliche TEER-Messung von Kulturen, die 48 Stunden lang steigenden TNF-α-Konzentrationen ausgesetzt waren. Die Daten sind der Durchschnitt von drei technischen Replikaten pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten, dargestellt mit Standardfehler. ANOVA mit Dunnett-Post-Test im Vergleich zu nur Medium. *=p<0,05, **=p<0,005, ***=p<0,001, ****=p<0,0001.

Das Hinzufügen von Scherkräften durch einen langsam rotierenden Orbital-Shaker und/oder zusätzliche BBB-relevante Zelltypen wie primäre Astrozyten oder SH-SY5Y kann die TEER-Messwerte im Vergleich zu statischen Kulturen von hCMEC/D3-Barrieren statistisch erhöhen.

Die Immunzytochemie-Färbung zeigt das Auftreten einer stärker linearen Ausrichtung der unter Scherbedingungen gezüchteten hCMEC/D3-Zellen.

Das EVOM™ Auto automatisiert schnell und reproduzierbar die Messungen des TEER in endothelialen Monolayern, die auf Corning Transwell 24-Well- und 96-Well-Permeablen Trägern kultiviert werden. Die Möglichkeit, die Barriereintegrität aseptisch und zerstörungsfrei zu überwachen, ermöglicht es Forschern, TEER effizient als Echtzeitmessung der Permeabilität für langfristige, longitudinale Studien einzusetzen – bei reduzierten Kosten und geringerer Variabilität.

Die Kombination aus dem EVOM Auto und den durchlässigen Corning Transwell-Trägern ermöglicht eine einfache Optimierung von Barriere-Modellen und Assays mit höherem Durchsatz.