Automatisierte TEER-Messungen

Epithelzellen des Dünndarms (SMI) wurden postmortal von Spendern nach IRB-Zulassung entnommen. SMI-Zellen wurden auf PermaCell™-Membranen mit hoher Porendichte (0,4 µm, 1,0x10^8 Poren/cm²) aus PET in 96-Well-Zellkulturplatten (MatTek Life Sciences; Ashland, MA) ausgesät, an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) gebracht und in einem speziell formulierten Kulturmedium, das die Differenzierung fördert, für 2 Wochen kultiviert. Ein Bild des PermaCell™ 96-Well-Systems und ein repräsentativer H&E-gefärbter Querschnitt des EpiIntestinal™ Gewebemodells sind in Abb. 1A-D dargestellt.

Abb. 1 – Messung des TEER an EpiIntestinal-Gewebe, das in der 96-Well-PermaCell-Platte mit hohem Durchsatz gewachsen ist. A) Plattendeckel. B) Einsatzplatte mit 0,4 µm Membranboden. C) Reservoirplatte. D) H&E-gefärbter Querschnitt des in der 96-Well-Einsatzplatte kultivierten EpiIntestinal™ Gewebes. E) Querschnitt von Einsatz- und Bodenplatten, gefüllt mit 100 mM KCl, zeigt TEER-Elektroden.

Vor den TEER-Messungen wurden die EpiIntestinal™-Gewebe in sterile 100 mM KCl-Lösung überführt (150 µL apikal, 400 µL basolateral). Der TEER wurde sowohl manuell mit einer STX HTS EVOM™ Elektrode in Verbindung mit dem EVOM™ Manual als auch automatisch mit dem EVOM™ Auto automatisierten TEER-Messsystem (World Precision Instruments, LLC, Sarasota, Florida) gemessen. Eine schematische Darstellung des Permacell™ 96-Well-Systems, die die Position der EVOM™ Auto 96 HTS Elektroden zeigt, ist in Abb. 1E dargestellt. Ein Vergleich zwischen dem EVOM™ Manual mit der STX HTS EVOM™ Elektrode und dem EVOM™ Auto System ist in Abb. 2A-B zu sehen. Die automatisierten Messungen erfolgten mit einer Messzeit von 2 Sekunden pro Well. Vor der TEER-Berechnung wurden die Widerstandsmessungen der Gewebeproben durch Subtraktion der Hintergrundwerte, basierend auf den Widerstandswerten der leeren 100 mM KCl-Pufferlösung in der Empfängerplatte der 96-Transwell-Anordnung, korrigiert.

Abb. 2 – Das EVOM™ Auto ermöglicht hochdurchsatzfähige TEER-Messungen. A) Das EVOM™ Manual mit STX HTS Elektrode in einer 96-Well Transwell-Platte benötigt 24 Minuten und 3 Sekunden, um 96 Proben zu messen. B) Das EVOM™ Auto System für die automatisierte TEER-Messung in einer 96-Well-Platte benötigt nur 4 Minuten und 10 Sekunden, um 96 Proben auszulesen.

Vor der Exposition gegenüber den Testsubstanzen wurden Basismessungen der Gewebe-Barrierefunktion (TEER) gemäß den oben genannten Methoden durchgeführt. Eine kurzfristige (dreistündige) Exposition gegenüber Ethylenglykol-Tetraessigsäure (EGTA) erfolgte unter Verwendung von 1X Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) mit 10 mM HEPES als Vehikel, das auf die apikale Oberfläche aufgetragen wurde. Eine langfristige (6-tägige) Exposition gegenüber Dextransulfat-Natriumsalz (DSS) wurde durch Zugabe von DSS zum Kulturmedium in sowohl den apikalen als auch den basolateralen Kompartimenten durchgeführt. Die reversible Gewebeschädigung, bewertet durch TEER, wird relativ zu den jeweiligen Vehikel-Kontrollgeweben angegeben.

Gewebeproben wurden 3 Stunden in 10 % Formalin fixiert, 30 Minuten mit 1X Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) mit 0,1 % Triton-X-100 permeabilisiert und 2 Stunden in 1X TBS mit 10 % normalem Ziegenserum blockiert. Der monoklonale rekombinante Kaninchen-Anti-Claudin 1-Antikörper (Abcam Kat.-Nr. ab211737, Cambridge, MA) wurde 1:1.000 in TBS verdünnt und bei Raumtemperatur 2 Stunden mit sanftem Schütteln inkubiert. Der Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor™ 555 (ThermoFisher Kat.-Nr. A21429, Waltham, MA) wurde 1:400 in TBS verdünnt und bei Raumtemperatur 1 Stunde mit sanftem Schütteln inkubiert. Die Zellkerne wurden mit 4’,6-Diamindino-2-phenylindol (DAPI) kontrastgefärbt. Bilder wurden mit einem Olympus FV1000 Konfokalmikroskop aufgenommen, sowohl mit einem 2X-Objektiv als auch mit einem 40X-Ölimmersionsobjektiv. Repräsentative Bilder der IHC-Färbung sind in Abb. 3D und Abb. 4D für die EGTA- bzw. DSS-Expositionen dargestellt.

Abb. 3 – Das EpiIntestinal™ Gewebemodell zeigt eine vollständige Erholung nach 30-stündiger Exposition gegenüber EGTA und 48-stündiger Nachinkubation. A) TEER-Messungen. B) Lucifer Yellow (LY) Permeabilität. C) Scheinbarer Permeabilitätskoeffizient für LY. Berechnungsformel:, wobei ΔQ/Δt die Konzentration von LY im basolateralen Kompartiment nach der verstrichenen Zeit ist, Vr das Volumen des Empfängerpuffers im basolateralen Kompartiment, A die Oberfläche des Gewebes und C die Anfangskonzentration von LY, die auf die apikale Oberfläche des Gewebes aufgetragen wurde. D) Immunfärbung für das Barriereprotein Claudin 1 (rot), kontrastgefärbt mit DAPI (cyan). Fehlerbalken = Standardabweichung. Abb. 4 – Auswirkungen auf das EpiIntestinal-Gewebemodell nach 6-tägiger Exposition gegenüber Dextransulfat-Natriumsalz (DSS) und 6-tägiger Nachinkubation. A) TEER-Messungen. B) Lucifer Yellow (LY) Permeabilität. C) Scheinbarer Permeabilitätskoeffizient für LY. Berechnungsformel: P app= ∆Q/∆t x Vr/(A*C), wobei ∆Q/∆t die Konzentration von LY im basolateralen Kompartiment nach der verstrichenen Zeit ist, Vr das Volumen des Empfängerpuffers im basolateralen Kompartiment, A die Oberfläche des Gewebes und C die Anfangskonzentration von LY, die auf die apikale Oberfläche des Gewebes aufgetragen wurde. D) Immunfärbung für das Barriereprotein Claudin 1 (rot), kontrastgefärbt mit DAPI (cyan). Fehlerbalken = Standardabweichung.

Gewebe wurden in 250 µL 1X HBSS mit 10 mM HEPES und 1,98 g/L Glukose überführt, und 50 µL einer 100 µM LY-Färbelösung im gleichen Puffer wurde auf die apikale Oberfläche aufgetragen. Die basolaterale Empfängerlösung (RS) wurde alle 30 Minuten für 2 Stunden ausgetauscht. Von jeder RS-Probe wurden 100 µL verwendet, um die LY-Konzentration in der RS zu jedem Zeitpunkt zu bestimmen. Die RS-Proben wurden mit einem Spectramax M2 Plattenleser (Molecular Devices, San Jose, CA) bei einer Anregungsbandbreite von 445-455 nm, einer Emissionsbandbreite von 518-538 nm und einer Sensitivitätseinstellung von 145 gemessen.

Abb. 5 – TEER-Messungen von EpiIntestinal™-Geweben, die in 96-Well PermaCell-Platten kultiviert wurden, sind mit dem EVOM™ Auto Messsystem konsistenter als mit dem EVOM™ Manual und können schneller erfasst werden, was die Handhabung erleichtert. A) EVOM™ Auto Messwerte waren reproduzierbarer und die Messzeit der Platte wurde im Vergleich zum EVOM™ Manual deutlich verkürzt. B) TEER-Werte vom EVOM™ Manual waren während des Messzeitraums weniger stabil als die vom EVOM™ Auto, die während der manuellen Messungen moderat anstiegen (p