Wie man Probleme bei der TEER-Messung behebt
Von Subhra Nag, PhD
Die Messung des transepithelialen/transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Bewertung der Zellgesundheit, wie z. B. Zellkonfluenz, Barriereintegrität oder Barrierefunktion von auf Multiwell-Platten gezüchteten Zellmonolayern. Die TEER-Messung mit dem Epithelial Voltohmmeter (EVOM) von WPI gilt als Goldstandard aufgrund seiner zuverlässigen Messungen und zahlreicher Literaturzitate mit verschiedenen Zelltypen. Das EVOM™ Handbuch und EVOM™ Auto zusammen mit verschiedenen Elektrodenoptionen (STX4, STX HTS High-Throughput-Screening, EndOhm-Kammern und Multielektroden-Array für EVOM™ Auto) ermöglichen es Forschern, Zellproben in 6, 12 und 24 entnehmbaren Einsätzen sowie in 24- und 96-Well-HTS-Multiwell-Plattenformaten zu messen und zu analysieren. Die größten Herausforderungen, denen Forscher bei der Durchführung von Studien zur Erfassung von TEER-Messungen begegnen können, sind:
- Instabile Messwerte
- Werte außerhalb des Messbereichs
- Inkonsistente Messungen zwischen Probenreplikaten oder Chargen.
Berücksichtigen Sie die folgenden Faktoren, um Probleme bei der TEER-Messung zu überwinden und genaue sowie zuverlässige Messwerte zu erhalten:
Vorhandensein von leitfähiger Flüssigkeit in den Proben
Um stabile Messungen zu erhalten, müssen die Elektrodenenden (aktive Messbereiche) in einer leitfähigen Flüssigkeit wie 1XPBS-Puffer, Zellkulturmedium usw. eingetaucht bleiben. Deionisiertes Wasser funktioniert nicht. Damit der vom EVOM angelegte Strom durch die Proben fließen kann, muss die Lösung Ionen (z. B. Chloridionen) enthalten. Die Ionenkonzentration und die gemessenen elektrischen Widerstandswerte stehen in umgekehrtem Verhältnis zueinander. Mit zunehmender Ionenkonzentration sollte der Widerstandswert entsprechend abnehmen. Um stabile und konsistente Messungen zu erzielen und sinnvolle Vergleiche anzustellen, verwenden Sie in allen Proben dasselbe Medium oder dieselben Puffersysteme.
Ausreichende Flüssigkeitsvolumina
Die Volumina der Flüssigkeit auf der Oberseite (apikal) und Unterseite (basolateral) der Membran der Multiwell- oder Zellkultureinsätze müssen ausreichend sein, damit die Elektrodenenden vollständig in der leitfähigen Lösung eingetaucht bleiben. Ein Mangel an ausreichendem Flüssigkeitsvolumen kann zu instabilen Messwerten oder Werten außerhalb des Messbereichs führen, da der Strom nicht konstant durch die Proben fließen kann. Wenn die Membran des Zellkultureinsatzes beschädigt ist, kann die apikale Flüssigkeit leicht zur basolateralen Seite gelangen. Solche Proben sollten aus Studien ausgeschlossen werden, da der elektrische Strom durch den Flüssigkeitsleckweg fließen kann und somit eine ungenaue Schätzung des elektrischen Widerstands liefert. Verwenden Sie konsistente Flüssigkeitsvolumina, um konsistente Messwerte zu erhalten.
Wählen Sie eine Elektrode passend zum Einsatz-/Plattentyp
WPI bietet eine große Auswahl an Elektroden, die den Abmessungen und der Geometrie gängiger Zellkultureinsätze (z. B. Corning, Millipore, MatTek, Greiner) mit verschiedenen Größen (6, 12, 24 und 96 Multiwells) entsprechen. WPI empfiehlt, für beste Ergebnisse eine Elektrode zu verwenden, die zum Zellkultureinsatz oder Multiwell-Typ passt. Zum Beispiel muss für Corning 3460 12-Well-Einsätze die ENDOHM-12 verwendet werden (Teilenummer ENDOHM-12G für EVOM2 oder EVM-EL-03-01-02 für EVOM™ Manual). Die mit einer nicht passenden Elektrode gesammelten Daten können erheblich ungenau sein.
Position der Elektrode über den Proben
Die Position der Elektrode (einschließlich ihrer Eintauchtiefe in die Proben) kann die Rohwiderstandswerte beeinflussen. Eine konsistente Elektrodenplatzierung sorgt für einen festen oder gleichbleibenden Weg des angelegten elektrischen Stroms durch die Proben und minimiert oder eliminiert Schwankungen der elektrischen Widerstandsmessungen. Die fortschrittlichen Elektroden von WPI, wie ENDOHM oder STX HTS, minimieren bei korrekter Verwendung mit passenden Multiwells diese Messvariabilität durch die Möglichkeit einer konsistenten Elektrodenpositionierung. Beim Einsatz von EVOM™ Auto eliminiert die automatisierte Bewegung des Roboterarms diesen Effekt ebenfalls, wenn dieselbe Elektrodenarray-/Plattenprofil-Einstellung konsequent verwendet wird.
Verwendung einer Leerprobe und Leerwertsubtraktion
Die „Leerprobe“ bezeichnet einen Zellkultureinsatz oder Multiwell ohne Zellen, der unter denselben experimentellen Bedingungen (einschließlich gleicher Flüssigkeitsart und -volumen) steht. Die Subtraktion des Leerwiderstandswerts vom Probenwiderstand und die anschließende Berechnung der TEER-Werte helfen, die Auswirkungen von Variabilitätsparametern wie Elektrodenpositionierung, Probenflüssigkeitstyp und -volumen zu minimieren. Sowohl EVOM™ Manual als auch EVOM™ Auto Systeme ermöglichen das Speichern der Leerwerte und deren automatische Subtraktion von den Probenwiderstandswerten.
Messung der Proben bei stabiler Temperatur
WPI empfiehlt, die Platten aus dem Inkubator zu nehmen und die Proben 20 Minuten bei Raumtemperatur im Zellkultur-Laminar-Flow-Schrank akklimatisieren zu lassen, bevor die Messung erfolgt. Wenn eine Platte direkt aus einem 37 °C-Inkubator gemessen wird, können große Schwankungen zwischen den Proben auftreten, da Probe 1 möglicherweise 37 °C hat, während Probe 12 derselben Platte nur 32 °C aufweist. Ebenso sollte vor der Messung bei Bedarf Raumtemperatur-akklimatisiertes Medium oder Lösung hinzugefügt werden. Die Temperatur beeinflusst die Permeabilität der Tight Junctions und somit die TEER-Messwerte. Daher müssen Messungen bei stabiler Temperatur durchgeführt werden, um stabile Werte zu erhalten.
Reinigung und Wartung der Elektrode
Die regelmäßige/tägliche Reinigung und Wartung der Elektrode ist entscheidend für die funktionale Lebensdauer der Elektrode. Elektroden neigen dazu, Salz- und Proteinablagerungen aus dem Medium oder Puffer anzusammeln, wenn sie nicht sofort nach Gebrauch oder am Ende des Tages gereinigt werden. Diese Ablagerungen können den aktiven Messbereich der Elektrode blockieren und zu niedrigen oder instabilen Messwerten führen. WPI empfiehlt eine regelmäßige Reinigung der Elektrode am Ende des Tages nach Gebrauch, um Ablagerungen im Messbereich zu vermeiden.
Die Elektrodenenden werden normalerweise mit Ethanol oder Isopropanol gewaschen, gefolgt von einer Spülung mit deionisiertem Wasser. Die Elektrodenenden müssen an der Luft trocknen, und die Elektrode sollte trocken gelagert werden. Eine periodische Reinigung der Elektrodenenden mit proteolytischen Reinigungsmitteln wie Enzol oder Alconox wird empfohlen, um Proteinablagerungen zu verhindern. Der übrige Teil der Elektrode, außer dem Messbereich an der Spitze, darf nicht in Flüssigkeit eingetaucht werden und kann mit einem mit Alkohol besprühten Papiertuch abgewischt werden. Eine periodische Chlorierung der Elektrodenenden oder des Messbereichs durch Eintauchen in 3–6 % Natriumhypochlorit (Bleichmittel) für 10 Minuten, gefolgt von einer Spülung mit deionisiertem Wasser, wird empfohlen. Dies dient der Auffrischung des Silberchlorids für eine ordnungsgemäße Funktion der Elektrode und stabile Messwerte. Weitere Details finden Sie im Reinigungs- und Wartungsabschnitt des jeweiligen Elektrodenhandbuchs.
Wenn Sie die oben genannten Vorschläge für Ihre TEER-Messungen befolgen, können Sie Probleme bei der TEER-Messung überwinden und stabile sowie reproduzierbare Ergebnisse erzielen. Bei Fragen rufen Sie uns einfach unter (866) 606-1974 an oder senden Sie eine E-Mail an wpi@wpiinc.com.
