DNA/RNA-Quantifizierung mit DIPUV-Mini und einem Tidas-Spektrometer

Zusammenfassung

Konzentrationen von DNA in Lösung (31µg/mL und 688µg/mL) wurden mit einem Spektrometer und einer UV/VIS-Lichtquelle in einem DIPUV-Mini gemessen. Aufgrund der 2mm Messweg-Länge erfordert die Verwendung eines DIPUV-Mini in diesem Konzentrationsbereich keine Verdünnung vor der Messung, wodurch eine potenzielle Fehlerquelle eliminiert wurde.

Experimentelles Verfahren

Standardlösungen von DNA (Sigma D1626) wurden gravimetrisch unter Verwendung von 18,2MΩ/cm ultrareinem Wasser als Lösungsmittel hergestellt. Die Lösungen wurden im Bereich von 0,0µg/mL bis 687,6µg/mL vorbereitet.

Messungen wurden dreifach mit einem DIPUV-Mini durchgeführt. Der DIPUV-Mini war mit einer UV/VIS-Lichtquelle (WPI #D4H) verbunden.

Daten wurden in 1nm-Schritten über den gesamten Bereich des Instruments (190nm-720nm) gesammelt. Das Instrument wurde so konfiguriert, dass Referenzmessungen eine Gesamtintensität von 80 % ergaben. Alle Messungen verwendeten 18,2MΩ/cm ultrareines Wasser als Referenzlösung.

Ergebnisse

Experimentelle Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt:

DNA [µg/mL]	Absorption @260nm [AU]
0.00	-0.0017
30.83	0.1116
56.59	0.1945
85.49	0.3012
115.66	0.3821
143.94	0.4551
281.63	0.8399
428.91	1.2409
561.15	1.5639
687.61	1.7340

Tabelle 1: DNA-Konzentrationen und resultierende Absorptionswerte

Da die Absorption in Bezug auf die Konzentration dem Lambert-Beer'schen Gesetz folgt,

A= εlc
Erwartete Absorptionswerte wurden aus den DNA-Lösungskonzentrationen berechnet. Literaturwerte von ε für dsDNA sind mit 0,020µg/ml*cm angegeben.

Experimentelle Daten sind in Abbildung 1 dargestellt, wobei die berechneten Absorptionsmessungen durch eine durchgezogene Linie angezeigt werden. Die Absorptionsmessungen werden bei einer Wellenlänge von 260nm angegeben. Abweichungen vom theoretischen Wert bei höheren Absorptionswerten sind auf Streulichtinterferenzen im Spektrometer zurückzuführen.